用于用抗ROR1免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法与流程

本技术涉及癌症领域，特别地涉及ror1抗原结合结构域和包含这样的ror1抗原结合结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)及其使用方法。

背景技术：

1、癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年影响接近130万例新患者，并且其是继心血管疾病之后第二位的死亡原因，引起大约四分之一的死亡。实体瘤是这些死亡中大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面已取得显著进展，但是在过去的20年内所有癌症的总体5年存活率仅提高约10％。癌症或恶性肿瘤转移并且以不受控制的方式迅速生长，使得治疗极其困难。

2、在实体瘤和液体瘤的治疗中有许多未满足的治疗需求。ror1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1)，是一种在许多癌症类型(包括cll、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺腺癌和肉瘤(尤因肉瘤(ewing sarcoma)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤))中高表达的胚胎蛋白，且通常在正常组织中不存在(suping zhang,et al.,2012,the onco-embryonic antigen ror1 is expressed by a variety ofhuman cancers.am j pathol,181:1903-1910,ashwini balakrishnan,et al.,2017,analysis of ror1 protein expression in human cancer and normal tissues.,clincancer res 23:3061-3071,borcherding,nicholas et al.,2017,ror1,an embryonicprotein with an emerging role in cancer biology.protein&cell5.7(2014):496-502)。ror1具有3个剪接变体，包括104kda(多至120kda，取决于糖基化)跨膜糖蛋白，其中包含937个氨基酸(1至29个信号肽)和2个较小的胞内和分泌形式变体(genebank np_005003,masiakowski,p.,and carroll,r.d.,1992,a novel family of cell surface receptorswith tyrosine kinase-like domain,j biol chem 36:26181-26190.)。ror1在转化的细胞表面的存在表明靶向ror1将使得能够针对一系列液体癌症(例如慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)和其他实体瘤)开发新的癌症治疗(borcherding,n.,kusner,d.et al.,2014,ror1,an embryonic protein with an emerging role incancer biology.protein&cell,5:496-502)。

3、尽管在成人组织中普遍不存，但至少有一项报告在甲状旁腺；胰岛；以及食管、胃和十二指肠的区域中发现ror1表达(ashwini balakrishnan,et al.,2017,analysis ofror1 protein expression in human cancer and normal tissues.,clin cancer res23:3061-3071)，承认在ror1靶向抗癌治疗的临床应用中应谨慎。ror1受体包含胞质蛋白激酶结构域，根据一些报告，其参与wnt和egfr信号传导(borcherding,n.,kusner,d.et al.,2014,ror1,an embryonic protein with an emerging role in cancerbiology.protein&cell,5:496-502)。在肿瘤中，ror1可诱导上皮-间充质转化(epithelialto mesenchymal transition，emt)，并促进肿瘤增殖、侵袭和转移形成，并介导对凋亡的抗性(yamaguchi,tomoya,et al.,2012,“nkx2-1/titf1/ttf-1-induced ror1 is requiredto sustain egfr survival signaling in lung adenocarcinoma.”cancer cell 21.3:348-361；borcherding,n.,kusner,d.et al.,2014,ror1,an embryonic protein with anemerging role in cancer biology.protein&cell,5:496-502)。它在促成肿瘤表型中的作用表明它可在肿瘤的发生或发展中提供重要的功能，并因此是一种驱动蛋白。

4、较早的癌症治疗方法包括外科手术、放射治疗、化学治疗以及针对血液肿瘤的骨髓移植。然而，目前的一线治疗值得进一步改善。通过新的免疫治疗策略寻求这样的改善。已经使用多种方式开发了靶向ror 1抗原的正在进行的临床前研究和临床试验。已在鼠和非人灵长类动物二者系统中测试了表达ror1特异性car的t淋巴细胞(huang x,park h,greene j,pao j,mulvey e,zhou sx,et al.,2015,igf1r-and ror1-specific cartcells as a potential therapy for high risk sarcomas.plos one 10(7):e0133152；hudecek m,schmitt tm,baskar s,lupo-stanghellini mt,nishida t,yamamoto tn,bleakley m,turtle cj,chang wc,greisman ha,wood b,maloney dg,jensen mc,raderc,riddell sr,2010,the b-cell tumor-associated antigen ror1 can be targetedwith t cells modified to express a ror1-specific chimeric antigenreceptor.blood 116:4532-41.)。非人灵长类动物中没有毒性，这提供了可开展人研究的信心(berger,c.,et al.,2015,safety of targeting ror1 in primates with chimericantigen receptor-modified t cells.cancer immunol res 3:2016-216.)。还提出了针对ror1的未经修饰的抗体和免疫毒素连接的抗体二者以用于治疗性用途(yang,jiahui,etal.,2011,"therapeutic potential and challenges of targeting receptor tyrosinekinase ror1 with monoclonal antibodies in b-cell malignancies."plos one 6.6:e21018；baskar,sivasubramanian,et al.,2012,"targeting malignant b cells withan immunotoxin against ror1."mabs,4:3,349-361.)。b谱系白血病的当前护理标准可由通过高剂量化学治疗或辐射进行的缓解诱导治疗接着是巩固组成，并且可以以干细胞移植和根据需要进行的另外的化学治疗过程为特征(参见万维网cancer.gov)。与这些治疗相关的高毒性以及并发症(例如复发、继发性恶性肿瘤或gvhd)的风险促使寻求更好的治疗选择。当前的开放式临床试验包括针对血液学恶性肿瘤的ror1靶向t细胞(在治疗患有晚期ror1+恶性肿瘤的患者中的经遗传修饰的t细胞治疗，nct02706392，主办者：fredhutchinson癌症研究中心，临床试验.gov访问9/20/2017。)，以及针对化学治疗的背景中给予的乳腺癌的ror1特异性抗体(circumtuzumab和紫杉醇用于转移性或局部性晚期不可切除乳腺癌的研究，nct02776917，主办者：barbara parker,md,university of california,san diego,临床试验.gov访问9/20/2017)。

5、嵌合抗原受体(car)是包含以下三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序、(2)连接/跨膜基序，以及(3)胞内t细胞信号传导基序(long ah,haso wm,orentasrj.lessons learned from a highly-active cd22-specific chimeric antigenreceptor,oncoimmunology.2013；2(4):e23621)。car的抗原结合基序通常在单链可变片段(single chain fragment variable，scfv)(免疫球蛋白(ig)分子的最小结合结构域)之后形成。还已改造了可替选的抗原结合基序，例如受体配体(即，已将il-13改造成结合肿瘤表达的il-13受体)、完整免疫受体、文库来源肽和先天免疫系统效应分子(例如nkg2d)。用于car表达的可替选细胞靶标(例如nk或γ-δt细胞)也在开发之中(brown ce et al clincancer res.2012；18(8):2199-209；lehner m et al.plos one.2012；7(2):e31210)。关于限定最活跃的t细胞群以用car载体进行传导、确定最佳的培养和扩增技术，以及限定car蛋白结构本身的分子细节仍然是需要完成的重要的工作。

6、car的连接基序可以是相对稳定的结构域(例如igg的恒定结构域)或被设计成延伸的柔性接头。结构基序(例如来源于igg恒定结构域的那些)可用于将scfv结合结构域延伸远离t细胞质膜表面。这对于一些其中结合结构域与肿瘤细胞表面膜特别接近的肿瘤靶标而言可以是重要的(例如对于二唾液酸神经节苷脂gd2而言；orentas et al.，未发表的观察结果)。迄今为止，用于car的信号传导基序通常包含cd3-ζ链，因为该核心基序是t细胞激活的关键信号。首次报道的第二代car以cd28信号传导结构域和cd28跨膜序列为特征。该基序还用于包含cd137(4-1bb)信号传导基序的第三代car(zhao y et al jimmunol.2009；183(9):5563-74)。随着新技术的出现，用与抗cd3和抗cd28抗体连接的珠激活t细胞和来自cd28的典型“信号2”的存在不再需要由car自身编码。通过使用珠激活，发现在体外测定中第三代载体并不优于第二代载体，并且在白血病的小鼠模型中第三代载体相对于第二代载体并未提供明显的益处(haso w,lee dw,shah nn,stetler-stevenson m,yuan cm,pastan ih,dimitrov ds,morgan ra,fitzgerald dj,barrett dm,wayne as,mackall cl,orentas rj.anti-cd22-chimeric antigen receptors targeting bcellprecursor acute lymphoblastic leukemia,blood.2013；121(7):1165-74；kochenderferjn et al.blood.2012；119(12):2709-20)。这通过第二代cd28/cd3-ζ中的cd19特异性car的临床成功(lee dw et al.american society of hematology annual meeting.neworleans,la；december 7-10,2013)和cd137/cd3-ζ信号传导格式(porter dl et al.nengl j med.2011；365(8):725-33)被证明。除cd137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如ox40)也能够在car转导的t细胞中提供重要的持续信号(yvon e et al.clincancer res.2009；15(18):5852-60)。同样重要的是培养car t细胞群的培养条件，例如包含细胞因子il-2、il-7和/或il-15(kaiser ad et al.cancer gene ther.2015；22(2):72-78)。

7、用于癌症的car治疗的更广泛且有效的适应中的目前的挑战与有力靶标的缺乏相关。建立细胞表面抗原的结合物现今是可容易实现的，但是发现对肿瘤具有特异性同时不伤害正常组织的细胞表面抗原仍然是艰巨的挑战。赋予表达car的t细胞以更大靶细胞特异性的一种潜在方式是使用组合的car方法。在一种系统中，将cd3-ζ和cd28信号单元分离在同一细胞内表达的两种不同car构建体中；在另一种系统中，在同一t细胞中表达两种car，但是一种具有较低的亲和力并且因此需要可替选的car首先进行衔接以使第二者具有完全活性(lanitis e et al.cancer immunol res.2013；1(1):43-53；kloss cc et al.natbiotechnol.2013；31(1):71-5)。产生基于单scfv的car作为免疫治疗剂的第二挑战是肿瘤细胞异质性。至少一个团队已经开发了用于胶质母细胞瘤的car策略，其中效应细胞群同时靶向多种抗原(her2、il-13ra、epha2)，希望避免靶抗原阴性群的结果(hegde m et al.molther.2013；21(11):2087-101)。

8、基于t细胞的免疫治疗已经成为合成生物学中的新前沿；预见多种启动子和基因产物将这些高度强效的细胞引导到肿瘤微环境，在此t细胞可避开负调节信号并且可介导有效的肿瘤杀伤。通过用基于化学品的二聚体(例如ap1903)进行诱导型胱天蛋白酶9构建体的药物诱导二聚化来消除不期望的t细胞表明其中可在药理学上开启可控制t细胞群的强大开关的一种方式(di stasi aet al.n engl j med.2011；365(18):1673-83)。通过诱饵受体的表达产生对转化生长因子β的负调节效应具有免疫的效应t细胞群进一步表明针对最佳抗肿瘤活性可以对效应t细胞进行改造的程度(foster ae et al.jimmunother.2008；31(5):500-5)。因此，虽然看起来car可以以类似于内源性t细胞受体的方式触发t细胞激活，但是该技术的临床应用的主要障碍迄今为止受限于car+t细胞的体内扩增、输注之后细胞的迅速消失和令人失望的临床活性。这可部分归因于所采用的一些car序列的鼠源。

9、已接受抗体或car-t治疗的患者随后经历hsct来维持持久应答的需求仍然是争论的热点。尽管报道了cd19 car-t试验的高响应，但至少有20％的患者近期失败(davis kl,mackall cl,2016,blood advances1:265-268)。所报道的car19治疗之后12个月时的最佳结果显示，在宾夕法尼亚大学(university of pennsylvania)能够接受t细胞产品的患者中，rfs为55％，且os为79％(maude sl,teachey dt,rheingold sr,shaw pa,aplenc r,barrett dm,barker cs,callahan c,frey nv,farzana n,lacey sf,zheng a,levine b,melenhorst jj,motley l,prter dl,june ch,grupp sa,2016,j clin oncol 34,no.15_suppl(may 2016)3011-3011)。考虑到预期的长期响应为50％或更少，仍然存在对新b细胞恶性肿瘤靶标(例如ror1)的大量临床需求。

10、本发明通过提供可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的car组合物和治疗方法来解决这些需求。特别地，如本文中所公开和描述的本发明提供了这样的car：其可用于治疗与ror1表达失调相关的疾病、障碍或病症，并且所述car包含ror1抗原结合结构域，其在转导t细胞上表现出高表面表达、表现出表达ror1的细胞的高度细胞溶解，并且在其中转导的t细胞表现出体内扩增和持续性。

技术实现思路

1、本文中提供了新的抗ror1抗体或其抗原结合结构域和包含这样的ror1抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)，以及表达所述受体的宿主细胞(例如，t细胞)，以及编码所述受体的核酸分子。car在转导的t细胞上表现出高表面表达，具有高度的细胞溶解，并且在体内具有转导的t细胞扩增和持续性。还提供了使用所公开的car、宿主细胞和核酸分子的方法，例如以在对象中治疗癌症。

2、因此，在一个方面中，提供了编码人抗ror1抗体或其片段的分离的多核苷酸，其包含选自seq id no:1和7的核酸序列。

3、在一个实施方案中，提供了编码完全人抗ror1抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或其片段包含选自fab片段、f(ab’)2片段、fv片段和单链fv(scfv)的片段。

4、在一个实施方案中，提供了编码完全人抗ror1抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2和8的氨基酸序列。

5、在一个方面中，提供了编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子，所述car从n端到c端包含至少一个ror1抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个ror1抗原结合结构域由包含选自seq id no:1和7的核酸序列的核苷酸序列编码。

6、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞外ror1抗原结合结构域包含与ror1结合的抗体的至少一个单链可变片段。

7、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞外ror1抗原结合结构域包含与ror1结合的抗体的至少一个重链可变区。

8、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的car胞外ror1抗原结合结构域还包含与ror1结合的至少一个基于脂质运载蛋白(lipocalin)的抗原结合抗原(抗运载蛋白(anticalin))。

9、在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外ror1抗原结合结构域通过接头结构域与跨膜结构域连接。

10、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中在所编码的ror1胞外抗原结合结构域之前是编码前导肽或信号肽的序列。

11、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，所述car包含至少一个ror1抗原结合结构域，所述至少一个ror1抗原结合结构域由包含选自seq id no:1和7的核酸序列的核苷酸序列编码，并且其中所述car另外编码靶向包括但不限于以下抗原的胞外抗原结合结构域：cd19、cd20、cd22、间皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage a3 tcr，或其任意组合。

12、在某些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中另外编码的胞外抗原结合结构域包含抗cd19 scfv抗原结合结构域、抗cd20scfv抗原结合结构域、抗cd22 scfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33 scfv抗原结合结构域、抗cd38scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138 scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2 scfv抗原结合结构域、抗gpc3 scfv抗原结合结构域、抗fgfr4 scfv抗原结合结构域、抗tslpr scfv抗原结合结构域、抗c-met scfv抗原结合结构域、抗pmsa scfv抗原结合结构域、抗糖脂f77 scfv抗原结合结构域、抗egfrviii scfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcr scfv抗原结合结构域、抗mage a3 tcr scfv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。

13、在一个方面中，本文中提供的car还包含接头或间隔区结构域。

14、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所述胞外ror1抗原结合结构域、所述胞内信号传导结构域或这二者通过接头(linker，l)、铰链(hinge，h)或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。

15、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于cd8或cd28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。

16、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的car还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd83、cd86、cd134、cd137和cd154，或其组合。

17、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域还包含cd3ζ胞内结构域。

18、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域相对于cd3ζ胞内结构域布置在n端侧。

19、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其组合。

20、在另一些实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其组合。

21、在一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其还包含前导序列或信号肽，其中前导或信号肽(lp)核苷酸序列包含seq id no:19的核苷酸序列。

22、在另一个实施方案中，提供了编码car的分离的核酸分子，其中所编码的前导序列包含seq id no:20的氨基酸序列。

23、在一个方面中，本文中提供了嵌合抗原受体(car)，其从n端到c端包含至少一个ror1抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。

24、在一个实施方案中，提供了car，其中所述胞外ror1抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段、或与抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，或其组合。

25、在另一个实施方案中，提供了car，其中所述至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154，tnfrsf19，或其组合。

26、在一些实施方案中，提供了car，其中car另外编码包含以下的胞外抗原结合结构域：cd19、cd20、cd22、间皮素、cd33、cd38、cd123(il3ra)、cd138、bcma(cd269)、gpc2、gpc3、fgfr4、tslpr、c-met、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、tslpr、ny-eso-1tcr、mage a3 tcr，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。

27、在一个实施方案中，提供了car，其中所述胞外抗原结合结构域包含抗cd19 scfv抗原结合结构域、抗cd20 scfv抗原结合结构域、抗cd22scfv抗原结合结构域、抗间皮素scfv抗原结合结构域、抗cd33 scfv抗原结合结构域、抗cd38 scfv抗原结合结构域、抗cd123(il3ra)scfv抗原结合结构域、抗cd138 scfv抗原结合结构域、抗bcma(cd269)scfv抗原结合结构域、抗gpc2 scfv抗原结合结构域、抗gpc3 scfv抗原结合结构域、抗fgfr4 scfv抗原结合结构域、抗tslpr scfv抗原结合结构域、抗c-met scfv抗原结合结构域、抗pmsascfv抗原结合结构域、抗糖脂f77 scfv抗原结合结构域、抗egfrviii scfv抗原结合结构域、抗gd-2scfv抗原结合结构域、抗ny-eso-1tcr scfv抗原结合结构域、抗mage a3 tcrscfv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。

28、在另一个实施方案中，提供了car，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。

29、在另一个实施方案中，提供了car，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其组合。

30、在一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:3的核酸序列(ltg1941lp-scfv4-cd8h/cd8tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2a))。在一个实施方案中，核酸序列编码包含seq id no:4的氨基酸序列(ltg 1941lp-scfv4-cd8h/cd8tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2a))的car。

31、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:5的核酸序列(ltg2528lp-scfv4-igg4h/cd8tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2b))。在一个实施方案中，核酸序列编码包含seq id no:6的氨基酸序列(ltg 2528lp-scfv4-1-igg4h/cd8tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2b))的car。

32、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:9的核酸序列(ltg1942lp-scfv9-cd8h/cd8tm-41bb-cd3ζcar核苷酸序列(图2c))。在一个实施方案中，核酸序列编码包含seq id no:10的氨基酸序列(ltg1942 lp-scfv9-cd8h/cd8tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2c))的car。

33、在另一个实施方案中，编码car的核酸序列包含seq id no:11的核酸序列(ltg2529 lp-scfv9-igg4h/cd8tm-41bb-cd3ζcar核酸序列(图2d))。在一个实施方案中，核酸序列编码包含seq id no:12的氨基酸序列(ltg2529 lp-scfv9-igg4h/cd8 tm-41bb-cd3ζcar氨基酸序列(图2d))的car。

34、在一个方面中，本文中所公开的car被修饰以表达或包含可检测标志物以用于诊断、监测和/或预测治疗结果(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展。

35、在一个实施方案中，编码所公开car的核酸分子可以包含在载体，例如病毒载体中。载体是dna载体、rna载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，或其组合。

36、在某些实施方案中，载体还包含启动子，其中所述启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子、组成型启动子、自杀型启动子(suicide promoter)，或其任意组合。

37、在另一个实施方案中，表达car的载体还可以被修饰以包含一个或更多个控制cart细胞表达或借助自杀开关来消除car-t细胞的操纵元件。自杀开关可以包括例如凋亡诱导性信号传导级联反应或诱导细胞死亡的药物。在一个优选实施方案中，表达car的载体还可以被修饰以表达酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase，tk)或胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，cd)。

38、在另一方面中，还提供了包含编码car的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是t细胞，例如从对象获得的原代t细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是cd8+t细胞。

39、在另一方面中，提供了包含抗肿瘤有效量的人t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2或8的氨基酸序列的人ror1抗原结合结构域，其中所述t细胞是患有癌症的人的t细胞。所述癌症尤其包括血液学癌症(hematologicalcancer)，例如白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，all)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，cml))，淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤(hodgkin’slymphoma))或多发性骨髓瘤，或其组合。

40、在一个实施方案中，提供了药物组合物，其中car的至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，间皮素，cd33，cd37，cd64，cd80，cd83，cd86，cd134，cd137，cd154，tnfrsf19，或其组合。

41、在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中所述人癌症包括成人癌(adultcarcinoma)，其包括：口腔和咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤)、中枢神经系统的肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任意组合。

42、在另一个实施方案中，提供了包含抗肿瘤有效量的患有癌症之人的人t细胞群的药物组合物，其中所述癌症是对一种或更多种化学治疗剂不具有响应性的难治性癌症。所述癌症包括造血系统癌症(hematopoietic cancer)，骨髓增生异常综合征，胰腺癌，头颈癌，皮肤肿瘤，急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓样白血病(acute myeloid leukemia，aml)、成人b细胞恶性肿瘤(包括cll(慢性淋巴细胞白血病)、cml(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma，nhl))、儿科b细胞恶性肿瘤(包括b谱系all(急性淋巴细胞白血病))中的微小残留病(minimal residual disease，mrd)，多发性骨髓瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，结肠癌，黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。

43、在另一方面中，提供了制备包含car的t细胞(下文中的“car-t细胞”)的方法。所述方法包括用编码特异性结合ror1的所公开car的载体或核酸分子转导t细胞，从而制备car-t细胞。

44、在另一方面中，提供了产生经rna改造细胞群的方法，其包括将编码所公开car的核酸分子的体外转录rna或合成rna引入到对象的细胞中，从而产生表达car的细胞。

45、在另一方面中，提供了用于诊断与细胞上ror1表达相关的疾病、障碍或病症的方法，其包括：a)使所述细胞与人抗ror1抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2或8的氨基酸序列；以及b)检测ror1的存在，其中ror1的存在诊断与ror1表达相关的疾病、障碍或病症。

46、在一个实施方案中，与ror1表达相关的疾病、障碍或病症是癌症，其包括造血系统癌症，骨髓增生异常综合征，胰腺癌，头颈癌，皮肤肿瘤，急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、成人b细胞恶性肿瘤(包括cll(慢性淋巴细胞白血病)、cml(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(nhl))、儿童b细胞恶性肿瘤(包括b谱系all(急性淋巴细胞白血病))中的微小残留病(mrd)，多发性骨髓瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，结肠癌，黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。

47、在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中诊断、预后或确定ror1相关疾病的风险的方法，其包括检测源自哺乳动物的样品中ror1的表达，其包括：a)使所述样品与人抗ror1抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2或8的氨基酸序列；以及b)检测ror1的存在，其中ror1的存在诊断哺乳动物中的ror1相关疾病。

48、在另一个实施方案中，提供了抑制ror1依赖性t细胞抑制的方法，其包括使细胞与人抗ror1抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2或8的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细胞选自表达ror1的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。

49、在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中阻断由表达ror1的细胞介导的t细胞抑制并改变肿瘤微环境以抑制肿瘤生长的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的包含分离的抗ror1抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:2和8的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细胞选自表达ror1的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。

50、在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中抑制、阻抑或阻止抗肿瘤或抗癌免疫应答的免疫抑制的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的包含分离的抗ror1抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段包含选自seq id no:seq id no:2和8的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体或其片段抑制第一细胞与t细胞之间的相互作用，其中所述第一细胞选自表达ror1的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。

51、在另一方面中，提供了用于在哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的经编码所公开car的载体或核酸分子转导的t细胞。

52、在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在哺乳动物中有效治疗或预防癌症的量向所述哺乳动物施用一种或更多种所公开的car。所述方法包括在以下条件下向对象施用治疗有效量的表达特异性结合ror1和/或一种或更多种前述抗原的所公开car的宿主细胞，所述条件足以在所述对象中形成car上的抗原结合结构域与ror1和/或一种或更多种前述抗原的胞外结构域的免疫复合物。

53、在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向该对象施用包含抗肿瘤有效量的t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个胞外ror1抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外ror1抗原结合结构域包含seq id no.2和8的氨基酸序列或其任意组合，并且其中所述t细胞是患有癌症的对象的t细胞。

54、在另一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的t细胞群的药物组合物，其中所述t细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中所述car包含至少一个ror1抗原结合结构域、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个ror1抗原结合结构域包含seq id no.2或8的氨基酸序列或其任意组合，其中所述t细胞是患有癌症的对象的t细胞。在前述方法的一些实施方案中，所述至少一个跨膜结构域包含以下的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd19，cd22，间皮素，cd33，cd37，cd64，cd80，cd83，cd86，cd134，cd137，cd154，tnfrsf16，tnfrsf19，或其组合。

55、在另一个实施方案中，提供了用于在被诊断患有癌症的人中产生持续性经遗传改造t细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向人施用被遗传改造成表达car的t细胞，其中所述car包含至少一个ror1抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述至少一个ror1抗原结合结构域包含seq id no.2或8的氨基酸序列或其任意组合，其中在施用之后，所述持续性经遗传改造t细胞群或所述t细胞的后代群在人中持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年或3年。

56、在一个实施方案中，人中的后代t细胞包含记忆t细胞。在另一个实施方案中，所述t细胞是自体t细胞。

57、在本文中所述的方法的所有方面和实施方案中，与肿瘤抗原表达升高相关的任一种前述癌症、疾病、障碍或病症都可使用本文中公开的一种或更多种car来治疗或预防或改善。

58、在另一方面中，提供了用于制备如上所述的嵌合抗原受体t细胞或用于如上所述在对象中预防、治疗或改善与肿瘤抗原表达升高相关的任一种癌症、疾病、障碍或病症的药盒(kit)，其包含容器和用于使用所述药盒的说明书，所述容器包含上文公开的核酸分子、载体、宿主细胞或组合物的任一种，或其任意组合。

59、应理解，car、宿主细胞、核酸和方法在本文中详细描述的特定方面和实施方案之外也是可用的。本公开内容的前述特征和优点将从以下详细描述变得更明显，该详细描述通过参照附图来进行。