一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法与流程

本发明涉及一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，属于遗传工程。

背景技术：

1、nk细胞是先天免疫系统的重要组成部分，能够杀死恶性和病毒感染的细胞，而不受mhc限制和事先不致敏。nk细胞对肿瘤细胞或感染细胞的杀伤活性是通过激活或抑制细胞表面受体介导的，包括杀伤免疫球蛋白受体(kirs)，天然细胞毒性受体(ncrs)和介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)的fcγ受体(fcγ riiia) cd16a，这些重要特征使nk细胞能够作为异体效应细胞，用于治疗难治性癌症和慢性感染疾病。

2、目前，大多数以nk细胞为基础的过继免疫治疗临床试验，使用的是自供者外周血来源的pb-nk细胞、脐带血来源的ucb-nk细胞。这些nk细胞来源有限，产量和质量不一，而且通常是nk细胞和免疫细胞的混合物。研究表明，ipsc来源的nk细胞具有强大的抗肿瘤和抗病毒活性。

3、cn102822332a涉及到将诱导性多能干细胞和人胚胎干细胞诱导成血管细胞继而诱导nk细胞的过程，其eb消化得到的单细胞接种到了methylcellulose培养体系中诱导得到血管细胞群，这一体系不利于临床级别规模化生产，且其最后的诱导效率相对较低。

4、cn114774365a至少存在以下一些问题：（1）全程用了成分不明确的昂贵的商业化培养基(如stempro 34)，使得产品成本过高；（2）cd34的表达率偏低，在75%左右。

5、cn115896019a由ipscs细胞诱导为cd34+造血干细胞中直接诱导后的细胞纯度为65.5%，进行分选后达到95.8%，利用磁珠分选增加了nk细胞生产过程中的成本，并且该专利得到的nk细胞的杀伤力水平有限。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，实现以下发明目的：提高cd34+造血干细胞和nk细胞的诱导率，提高nk细胞的杀伤力。

2、为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

3、一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，所述方法包括hipscs诱导分化为拟胚体细胞、拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞、中胚层细胞诱导分化为cd34+造血干细胞、cd34+造血干细胞诱导分化为nk细胞、nk细胞的扩增培养；所述hipscs诱导分化为拟胚体细胞步骤中，采用的培养基为dmem/f-12培养基中添加终浓度为10μm的y-27632、10μm的sb431542、50ng/ml的vegf、10ng/ml的igf1、100ng/ml的l-抗坏血酸。

4、所述拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞步骤中，采用的培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ng/ml的bmp4、50ng/ml的vegf、50ng/ml的fgf2、10μm的chir99021、10μm的sb431542。

5、所述中胚层细胞诱导分化为cd34+造血干细胞步骤中，采用的培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ng/ml的bmp4、30ng/ml的scf、50ng/ml的tpo、20ng/ml的flt-3l、20ng/ml的il-6、20ng/ml的il-7、25μm的噻唑烷、50ng/ml的lif。

6、所述cd34+造血干细胞诱导分化为nk细胞步骤中，采用的培养基为nk细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/ml的scf、30ng/ml的tpo、50ng/ml的flt-3l、30ng/ml的il-2、20ng/ml的il-6、20ng/ml的il-15。

7、所述nk细胞的扩增培养步骤中，采用的培养基为nk细胞扩增培养基中添加终浓度均为20ng/ml的il-2、il-6、il-12、il-18因子外，另外添加终浓度为5μm的鹰爪豆碱。

8、所述无血清分化培养基为dmem/f-12培养基中，添加终浓度为100μg/ml的聚乙烯醇、100μm的硫代甘油、20μm的乙醇胺、100μg/ml的r-hsa、125μm的l-抗坏血酸、0.25μm的亚油酸、10ng/ml的igf1、100ng/ml的肝素。

9、与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

10、本发明由hipscs分化为nk细胞的过程中，cd34+造血干细胞的表达量为91.8%；cd3-cd56+nk细胞的比率为84.7%，明显高于对照nk细胞；

11、本发明诱导得到的nk细胞对靶细胞的杀伤能力与脐血来源的nk细胞一致甚至更强；

12、本发明诱导的nk细胞相对于对照nk细胞，对靶细胞具有更高的体外杀伤率，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强，在效靶比8:1时，本发明nk细胞对靶细胞的杀伤率高达94.25%，明显高于对照nk细胞的杀伤率。

技术特征：

1.一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述方法包括hipscs诱导分化为拟胚体细胞、拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞、中胚层细胞诱导分化为cd34+造血干细胞、cd34+造血干细胞诱导分化为nk细胞、nk细胞的扩增培养；所述hipscs诱导分化为拟胚体细胞步骤中，采用的培养基为dmem/f-12培养基中添加终浓度为10μm的y-27632、10μm的sb431542、50ng/ml的vegf、10ng/ml的igf1、100ng/ml的l-抗坏血酸。

2.根据权利要求1所述的一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞步骤中，采用的培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ng/ml的bmp4、50ng/ml的vegf、50ng/ml的fgf2、10μm的chir99021、10μm的sb431542。

3.根据权利要求1所述的一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述中胚层细胞诱导分化为cd34+造血干细胞步骤中，采用的培养基为无血清分化培养基中添加终浓度为25ng/ml的bmp4、30ng/ml的scf、50ng/ml的tpo、20ng/ml的flt-3l、20ng/ml的il-6、20ng/ml的il-7、25μm的噻唑烷、50ng/ml的lif。

4.根据权利要求1所述的一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述cd34+造血干细胞诱导分化为nk细胞步骤中，采用的培养基为nk细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/ml的scf、30ng/ml的tpo、50ng/ml的flt-3l、30ng/ml的il-2、20ng/ml的il-6、20ng/ml的il-15。

5.根据权利要求1所述的一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述nk细胞的扩增培养步骤中，采用的培养基为nk细胞扩增培养基中添加终浓度均为20ng/ml的il-2、il-6、il-12、il-18因子外，另外添加终浓度为5μm的鹰爪豆碱。

6.根据权利要求2或3所述的一种hipscs诱导分化为nk细胞的方法，其特征在于：所述无血清分化培养基为dmem/f-12培养基中，添加终浓度为100μg/ml的聚乙烯醇、100μm的硫代甘油、20μm的乙醇胺、100μg/ml的r-hsa、125μm的l-抗坏血酸、0.25μm的亚油酸、10ng/ml的igf1、100ng/ml的肝素。

技术总结
本发明提供一种hiPSCs诱导分化为NK细胞的方法，所述方法包括hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞、拟胚体细胞诱导分化为中胚层细胞、中胚层细胞诱导分化为CD34<supgt;+</supgt;造血干细胞、CD34<supgt;+</supgt;造血干细胞诱导分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养；所述hiPSCs诱导分化为拟胚体细胞步骤中，采用的培养基为DMEM/F‑12培养基中添加终浓度为10μM的Y‑27632、10μM的SB431542、50ng/mL的VEGF、10ng/mL的IGF1、100ng/mL的L‑抗坏血酸。本发明CD34<supgt;+</supgt;造血干细胞和NK细胞的诱导率均较高，本发明得到的NK细胞对靶细胞具有更高的体外杀伤率。

技术研发人员：刘明录,冯建海,金海锋,强邦明,王立新,韩庆梅,张传鹏,许淼
受保护的技术使用者：上海兴瑞一达生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15