一株内生绿木霉WJ561及其在防治梨树腐烂病中的用途

本发明属于微生物，尤其是一株内生绿木霉wj561及其在防治梨树腐烂病中的用途。

背景技术：

1、梨，在世界范围内广泛种植和消费，仅次于柑橘和苹果。梨树腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌梨变种-梨黑腐皮壳菌(valsa mali var.pyri)引起的一种毁灭性的真菌病，可导致梨树减产甚至树体死亡，对种植者、消费者和整个行业产生负面影响。在过去的几十年里，物理和化学干预手段常被用于治疗梨树腐烂病。物理方法包括修剪和去除病变、感染的树枝，但并不能有效地根除疾病，在某些情况下，可能会还加剧对树木的伤害。而化学杀菌剂易残留，具有潜在毒性和生态危害以及病原菌产生耐性等问题也日益显著。因此，急需寻求防治梨树腐烂病的理想替代方法。在可持续农业实践方面，生物防治已成为管理植物病害的有力工具。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株内生绿木霉wj561及其在防治梨树腐烂病中的用途。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一株内生绿木霉wj561，其名称为：wj561，分类名称为：绿木霉(trichodermavirens)，保藏编号为：cgmcc no.40848，保藏日期：2023年10月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4、进一步地，所述绿木霉wj561菌株从河北无极县一姜根茎内分离得到，分离方法如下：取姜根茎，用自来水冲洗干净后，经过75％酒精表面消毒，再用无菌水冲洗3次，根茎置于超净台中适当干燥后用灭菌小刀将根茎切成0.5cm见方小块，再置于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上，28℃培养6天；从根茎块生长出来的真菌分离株在相同的培养基上传代培养、纯化，通过its和rna聚合酶ⅱ亚基序列测序和结果比对，鉴定为绿木霉。

5、进一步地，所述绿木霉wj561，具有如下特征：

6、在28℃培养1天后，所有菌株在pda培养基上均呈现白色绒毛状，背面白色(图1a和b)；培养到第3天时，各培养基中央出现浅绿色至深绿色的孢子带，并逐渐向周围延伸，菌丝体呈致密棉絮状(图1c和d)；到第5天，绿色孢子以同心圆环散布在整个培养皿中，呈现出深绿色、灰绿色或黄绿色的轮纹(图1e和f)，初步鉴定其为木霉属。通过its、tef1-α和rpb2序列测序和结果比对，鉴定wj561为绿木霉。

7、如上所述的绿木霉wj561制备获得的培养滤液。

8、如上所述的培养滤液的制备方法，具体步骤如下：

9、将新鲜培养4-6天龄的绿木霉菌饼，放入马铃薯葡萄糖水(pdb)培养基中，25-28℃、140-160rpm培养2、4、6、10、14天后，用12层灭菌擦镜纸过滤后，再用0.1μm微孔滤膜过滤器过滤2次，获得培养滤液。

10、进一步地，具体步骤如下：

11、用200微升无菌枪头打取8个新鲜培养5天龄的绿木霉菌饼，放入马铃薯葡萄糖水(pdb)培养基中，28℃、150rpm培养4天后，用12层灭菌擦镜纸过滤后，再用0.1μm聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤器过滤2次，获得培养滤液。

12、如上所述的培养滤液在抑制梨树腐烂病菌的生长和/或制备用于抑制梨树腐烂病菌的制剂和/或防治梨树腐烂病菌所致病害和/或制备用于防治梨树腐烂病菌所致病害的制剂中的应用。

13、进一步地，所述梨树腐烂病菌为梨黑腐皮壳菌；

14、或者，所述制剂为绿木霉wj561培养滤液与无菌pdb培养基的混合物；

15、或者，所述制剂为包含质量浓度为0％、5％、10％和15％绿木霉wj561培养滤液的制剂。

16、进一步地，所述制剂在引起梨树腐烂病菌细胞膜损伤和/或引起梨树腐烂病菌细胞氧化性损伤和/或抑制引起梨树腐烂病菌抗氧化酶产生和/或减轻病菌对植物叶片的致病性和/或减轻病菌对植物枝条的致病性中的应用。

17、进一步地，所述梨树腐烂病菌梨黑腐皮壳菌。

18、或者，所述植物为红肖梨。

19、本发明取得的优点和积极效果为：

20、1、本发明从姜根茎中分离得到一株内生绿木霉(trichoderma virens)wj561，具有优越的抗菌性能。该菌株对引起梨树腐烂病的病菌梨黑腐皮壳菌有明显的拮抗作用，抑制率达66.02％且当wj561优先接种1天时，抑制率高达92.41％；对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌等都具有较好的拮抗效果。

21、2、本发明wj561的培养滤液也可以抑制病原菌的生长，在2天内抑制率高达100％，而且在15％浓度的培养滤液即可抑制病原菌的抗氧化能力，导致活性氧积累和病菌菌丝的严重的氧化损伤。在离体试验中，wj561培养滤液也能抑制梨树腐烂病发展程度。此外，wj561培养滤液具有良好的环境稳定性，为后期生产奠定基础。

技术特征：

1.一株内生绿木霉wj561，其特征在于：其名称为：wj561，分类名称为：绿木霉(trichoderma virens)，保藏编号为：cgmcc no.40848，保藏日期：2023年10月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的绿木霉wj561，其特征在于：所述绿木霉wj561菌株从河北无极县一姜根茎内分离得到，分离方法如下：取姜根茎，用自来水冲洗干净后，经过75％酒精表面消毒，再用无菌水冲洗3次，根茎置于超净台中适当干燥后用灭菌小刀将根茎切成0.5cm见方小块，再置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃培养6天；从根茎块生长出来的真菌分离株在相同的培养基上传代培养、纯化，通过its和rna聚合酶ⅱ亚基序列测序和结果比对，鉴定为绿木霉。

3.根据权利要求1所述的绿木霉wj561，其特征在于：所述绿木霉wj561，具有如下特征：

4.如权利要求1至3任一项所述的绿木霉wj561制备获得的培养滤液。

5.如权利要求4所述的培养滤液的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

6.根据权利要求5所述的培养滤液的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

7.如权利要求4所述的培养滤液在抑制梨树腐烂病菌的生长和/或制备用于抑制梨树腐烂病菌的制剂和/或防治梨树腐烂病菌所致病害和/或制备用于防治梨树腐烂病菌所致病害的制剂中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述梨树腐烂病菌为梨黑腐皮壳菌；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述制剂在引起梨树腐烂病菌细胞膜损伤和/或引起梨树腐烂病菌细胞氧化性损伤和/或抑制引起梨树腐烂病菌抗氧化酶产生和/或减轻病菌对植物叶片的致病性和/或减轻病菌对植物枝条的致病性中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述梨树腐烂病菌梨黑腐皮壳菌；

技术总结
本发明属于微生物应用技术领域，公开了一株内生绿木霉WJ561及其在防治梨树腐烂病中的用途，所述内生绿木霉WJ561分类命名为绿木霉(Trichoderma virens)，生物保藏号为CGMCC NO.40848。本发明获得的内生绿木霉WJ561对梨树腐烂病菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌等均具有拮抗作用；培养滤液具有较好的抑菌活性，通过氧化损伤破坏病菌菌丝细胞并抑制病菌抗氧化能力，2天内对梨树腐烂病菌菌丝生长的抑制率可达100％。在梨树叶片和枝条的离体试验中，培养滤液能有效抑制病斑进展，防治梨树腐烂病。

技术研发人员：何裕建,张阳,白如霄,王军,尹飞虎
受保护的技术使用者：中国科学院大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17