一种提高质粒转染效率的方法与流程

本发明属于细胞工程，具体涉及一种提高质粒转染效率的方法。

背景技术：

1、基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因，引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础，即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。重组腺相关病毒(aav)基因治疗技术，其具有安全性、有效性、特异性等多种优势，目前被广泛应用。

2、目前aav生产主要的方法为三质粒转染293t细胞方法，其操作简单、快速，但是aav包装颗粒量低产，这大大限制了aav规模化生长，原因在于现在病毒的转染效率太低，一般不高于50％，因此，有必要提供一种提高质粒转染效率的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高质粒转染效率的方法，以解决现有腺相关病毒转染效率低的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种提高质粒转染效率的方法，包括以下步骤：

4、s1、将细胞复苏至t75方瓶中，使用含有0.8-2g的三抗营养液培养三代后，收获细胞状态较好的293t悬浮细胞，分别接种入3个药瓶中进行培养至细胞培养参数为接种密度在1.0×105-30.0×105个/ml，放入培养箱，温度35-38℃，co2浓度为3-7％，培养20-28h，细胞汇合率达到80-90％，得到含悬浮细胞的混悬液；

5、s2、将含悬浮细胞的混悬液于转速1000-1500r/min下离心1-10min，去除上清液，然后加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得到转染混合液；

6、s3、将转染混合液放入co2恒温振荡培养箱，温度25-37℃，转速0-50r/min，co2浓度为3-7％，培养1-6h后加入体积一半的含有1-20％牛血清的培养液进行培养，温度35-38℃，转速50-100r/min，co2浓度为3-7％，继续培养20-28h，得到含腺相关病毒的混合液；

7、s4、将含腺相关病毒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1-10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，同时使用流式细胞仪进行细胞转染率测试，即可。

8、进一步地，s1中三抗由青霉素、四环素和氨基糖苷按照质量比5：5：2组成。

9、进一步地，s2中含腺相关病毒的转染混合液中质粒的量为100-1800μg。

10、进一步地，s2中含腺相关病毒的转染混合液的体积为10-90ml，ph值为6.0-7.4，所述含腺相关病毒的转染混合液中包含质粒浓度为2.5mg/ml的转染助剂溶液，且转染助剂溶液的加入量为0.5-4.5ml。

11、进一步地，s2中含腺相关病毒的转染混合液中质粒由pdeltaf6、prep2cap2及raav2egfp按照质量比为2：2：1组成。

12、进一步地，转染助剂获得步骤如下：

13、步骤a、将十二烷基缩水甘油醚、反丁烯二酸和无水dmf加入反应釜中，加入四丁基溴化铵，升温至100℃搅拌反应72h得到粗产物，将粗产物用氯仿溶解后，加入甲醇使之沉淀，收集沉淀，干燥后得到接枝剂；

14、其中，十二烷基缩水甘油醚、反丁烯二酸、无水dmf和四丁基溴化铵的用量比为4mmol：2mmol：5-10ml：0.02-0.024mmol，以四丁基溴化铵为催化剂，使十二烷基缩水甘油醚的环氧基与反丁烯二酸的羧基发生开环反应，形成酯键和新的羟基，得到接枝剂；

15、步骤b、将聚乙烯亚胺、接枝剂和无水二氯甲烷加入反应釜中，氮气保护下，升温至45℃反应72h，反应结束后，用无水甲醇溶解后，用无水乙醚沉淀，收集沉淀，干燥，得到转染助剂；

16、其中，聚乙烯亚胺、接枝剂和无水二氯甲烷的用量比为4.6-5.3g：0.8-1.2g：5-10ml，聚乙烯亚胺为pei600da，购买于阿拉丁试剂公司，以转染助剂和聚乙烯亚胺为原料，通过氨基与不饱和双键之间的michael加成反应得到转染助剂。

17、本发明的有益效果：

18、本发明提供一种提高质粒转染效率的方法，主要在于提高腺病毒转染效率的方法，具体在细胞转染过程中加入转染助剂，其为一种阳离子基因载体，能够与质粒通过静电相互作用形成纳米复合物，基于纳米复合物与细胞膜的静电相互作用，纳米复合物能够被细胞内吞，有效释放基因而高效表达，相比于单纯采用聚乙烯亚胺而言，通过疏水修饰，在聚乙烯亚胺分子链上引入酯基和疏水长链，可以提高纳米复合物与细胞膜的融合作用，从而增加细胞内吞，进而提高转染效果，另外，疏水修饰还可以增加聚乙烯亚胺包裹质粒的能力，因此，本发明经过多次尝试，确定转染助剂的合理用量，最终将病毒的转染效率提升至90％以上，不仅节约了大量材料，而且制备方法简单，适用范围广，极大地节约成了成本。

技术特征：

1.一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，s1中三抗由青霉素、四环素和氨基糖苷按照质量比5：5：2组成。

3.根据权利要求1所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，s2中含腺相关病毒的转染混合液中质粒的量为100-1800μg。

4.根据权利要求1所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，s2中含腺相关病毒的转染混合液的体积为10-90ml，ph值为6.0-7.4，所述含腺相关病毒的转染混合液中包含质粒浓度为2.5mg/ml的转染助剂溶液，且转染助剂溶液的加入量为0.5-4.5ml。

5.根据权利要求1所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，s2中含腺相关病毒的转染混合液中质粒由pdeltaf6、prep2cap2及raav2egfp按照质量比为2：2：1组成。

6.根据权利要求1所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，转染助剂获得步骤如下：

7.根据权利要求6所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，十二烷基缩水甘油醚、反丁烯二酸、无水dmf和四丁基溴化铵的用量比为4mmol：2mmol：5-10ml：0.02-0.024mmol。

8.根据权利要求6所述的一种提高质粒转染效率的方法，其特征在于，聚乙烯亚胺、接枝剂和无水二氯甲烷的用量比为4.6-5.3g：0.8-1.2g：5-10ml，聚乙烯亚胺为pei600da。

技术总结
本发明公开了一种提高质粒转染效率的方法，属于细胞工程技术领域，包括以下步骤：S1、得到含悬浮细胞的混悬液；S2、将含悬浮细胞的混悬液离心，去除上清液，然后加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得到转染混合液；S3、将转染混合液放入CO2恒温振荡培养箱，培养1‑6h后加入体积一半的含有1‑20％牛血清的培养液进行培养，继续培养20‑28h，得到含腺相关病毒的混合液；S4、使用流式细胞仪进行细胞转染率测试，即可，本发明经过多次尝试，确定转染助剂的合理用量，最终将病毒的转染效率提升至90％以上，不仅节约了大量材料，而且制备方法简单，适用范围广，极大地节约成了成本。

技术研发人员：喻明军,崔康乐,王维坤,骆晓文,陈子辉,杨齐峰,陈健
受保护的技术使用者：通用生物（安徽）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27