Sso7d-TaqDNA聚合酶融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、在核酸检测过程中，样本保存试剂(灭火病毒型)、核酸提取液都会引入pcr抑制剂，从而影响荧光定量pcr检测灵敏度。常见的抑制剂主要有高浓度非离子表面活性剂(np-40，tween20，triton x-100等)、无机盐(氯化钠，异硫氰酸胍等)、有机物(乙醇、异丙醇)等。因此有必要寻找一种解决上述pcr抑制剂影响荧光定量pcr检测灵敏度的措施。

2、sso7d蛋白是来自极端嗜热古生菌硫磺矿硫化叶菌的小分子dna结合蛋白，相对分子质量为7.3×103，耐热性强(tm>90℃)，具有与双链脱氧核糖核酸(dsdna)非特异性结合的特性。它大量存在于嗜热古细菌中,并对稳定基因组中起着重要的作用。融合了蛋白后，在复制过程中聚合酶在模板上移动时获得了一个牢固的把手。sso7d结构域增强了酶-模板-引物复合物的稳定性，可以识别退火后的双链，从而协助聚合酶快速识别延伸的起点，极大的地增强了原聚合酶的延伸速率。

3、融合蛋白含义是通过dna重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。构建融合蛋白的原则是将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现2个基因的融合表达。

4、作为融合蛋白重组不可或缺的组成部分，linker在构建稳定、具有生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用。linker为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。

5、蛋白linker通常分为3种，分别为flexible linker(柔性linker)、rigid linker(刚性linker)和cleavable linker(可剪切linker)。没有linker的功能区域直接融合可能会导致许多不良的结果，包括融合蛋白的错误折叠、蛋白产量低或生物活性受损等。因此，选择或合理设计连接融合蛋白结构域的linker是重组融合蛋白技术中一个重要的领域。

6、sso7d-taq酶直接连接很不稳定，很多taq酶突变体sso7d-taq酶直接连接并没有活性。

7、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，以解决上述问题中的至少一种。

2、本发明的第二目的在于提供上述sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白在pcr中的应用。

3、本发明的第三目的在于提供一种编码上述sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白的基因。

4、本发明的第四目的在于提供一种重组质粒。

5、本发明的第五目的在于提供一种基因工程菌。

6、第一方面，本发明提供了一种sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，主要由sso7d蛋白结构域、taq dna聚合酶结构域和连接短肽构成；

7、所述连接短肽的n端与sso7d蛋白结构域的c端连接，所述连接短肽的c端与taqdna聚合酶结构域的n端连接；

8、所述连接短肽具有如seq id no.7所示的氨基酸序列。

9、作为进一步技术方案，编码所述连接短肽的核苷酸具有如seq id no.8所示的序列。

10、作为进一步技术方案，所述sso7d蛋白结构域具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；

11、作为进一步技术方案，编码所述sso7d蛋白结构域的核苷酸具有如seq id no.4所示的序列。

12、作为进一步技术方案，所述taq dna聚合酶结构域具有如seq id no.2所示的氨基酸序列或者具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；

13、作为进一步技术方案，编码所述taq dna聚合酶结构域的核苷酸具有如seq idno.5所示的序列或者具有如seq id no.6所示的序列。

14、第二方面，本发明提供了一种sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白在pcr中的应用。

15、第三方面，本发明提供了一种编码上述sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白的基因。

16、第四方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述基因；

17、优选地，所述载体包括pet26b。

18、第五方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；

19、优选地，所述基因工程菌包括大肠杆菌。

20、本发明提供的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白具有如下有益效果：

21、1.相比sso7d-taq直连方式，增加该链接短肽后，比活力最高提升了3.33倍。

22、2.相对于sso7d-taq直连方式，增加该链接短肽后，融合蛋白的延伸速率显著增加，适合快速pcr模式，大大节省样本检测时间。

23、3.相对于sso7d-taq直连方式，增加该链接短肽后，对抑制剂抗性明显增强：无机盐(如氯化钠)、有机溶剂(如乙醇、异丙醇)耐受性明显增强。

24、4.加入链接短肽后，sso7d-taq融合蛋白会保留5’→3’端外切酶活性，可切割荧光探针，可用于taqman探针pcr，进一步扩大了本发明应用范围。

技术特征：

1.一种sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，主要由sso7d蛋白结构域、taqdna聚合酶结构域和连接短肽构成；

2.根据权利要求1所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，编码所述连接短肽的核苷酸具有如seq id no.8所示的序列。

3.根据权利要求1所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，所述sso7d蛋白结构域具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，编码所述sso7d蛋白结构域的核苷酸具有如seq id no.4所示的序列。

5.根据权利要求1所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，所述taq dna聚合酶结构域具有如seq id no.2所示的氨基酸序列或者具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白，其特征在于，编码所述taqdna聚合酶结构域的核苷酸具有如seq id no.5所示的序列或者具有如seq id no.6所示的序列。

7.权利要求1-6任一项所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白在pcr中的应用。

8.编码权利要求1-6任一项所述的sso7d-taq dna聚合酶融合蛋白的基因。

9.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求8所述的基因；

10.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求9所述的重组质粒；

技术总结
本发明提供了一种Sso7d‑Taq DNA聚合酶融合蛋白及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供的Sso7d‑Taq DNA聚合酶融合蛋白，主要由Sso7d蛋白结构域、Taq DNA聚合酶结构域和连接短肽构成；连接短肽的N端与Sso7d蛋白结构域的C端连接，连接短肽的C端与Taq DNA聚合酶结构域的N端连接。该融合蛋白保留有5’→3’端外切酶活性，比活力高、对抑制剂抗性明显增强、扩增速率快，适合快速PCR模式。

技术研发人员：陈芝娟,王虹军,贺贤汉
受保护的技术使用者：杭州博日科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17