一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用

本发明涉及羊重组抗菌肽，具体涉及重组绵羊β防御素2蛋白在毕赤酵母中的表达和抗菌活性验证。

背景技术：

1、随着对抗生素的研究越来越广泛，已有60多种抗生素应用于畜牧业，在动物疫病的预防和治疗、提高饲料利用效率、促进畜禽快速生长等方面均发挥了重要作用。然而随着抗生素长期亚治疗剂量的添加和滥用，耐药菌产生、菌群失调、不良反应、药物残留等已严重影响了动物性食品的安全，危害了环境及人的健康，寻求绿色、高效的抗生素替代品成为了研究的重点。抗菌肽(antimicrobial peptides，amp)是自然界中广泛存在的多肽物质，作为机体先天免疫的关键组成部分，具有抗细菌、真菌、肿瘤、病毒等生物学功能。amps因不易产生耐药性、无残留等优点，成为抗生素替代品研究的热点之一。

2、对于反刍动物而言，瘤胃是营养发酵的重要器官，能够产生如短链脂肪酸和微生物蛋白质，为个体提供能量和蛋白质。研究发现，饲粮中添加amps(例如，pbd-m1和luc-n)可以有效改善瘤胃发酵功能，使乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度得到提高，同时通过改善瘤胃微生物群结构，使瘤胃发酵参数发生改变，提高了饲料利用率。此外，《sbd2对湖羊抗f17大肠杆菌感染的作用及其调控机制研究》的结果表明，β防御素2是反刍动物消化道(主要是肠道)抗感染的重要内源性成分。

3、目前蛋白表达一般选用原核表达系统，其优点在于表达周期短、表达量高，但也存在一些缺点：表达的蛋白没有经过修饰，无法保证具有天然蛋白的活性，所表达蛋白可用于抗体制备或检测，较少用来表达具有生物学活性的蛋白；无法对表达时间及表达水平进行调控，有些目的基因过量表达会导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难。而利用毕赤酵母这一真核宿主可以实现目的蛋白的可溶性表达并最大程度保留其生物活性，且只需简单除菌、冻干即可应用于生产。

4、尽管羊抗菌肽在大肠杆菌原核表达系统以及毕赤酵母真核表达系统中的表达有诸多研究，但是目前未见到绵羊β防御素2(sbd2)外源性表达的相关报道。中国专利cn101538582a中提出了鸭β-防御素2重组蛋白的表达方法，但受到反刍动物消化道生理环境、菌群影响，鸭β-防御素2重组蛋白并不能在投喂羊等反刍动物后发挥其抗菌活性。

5、另外，中国专利cn1699416a中提出了富含甘氨酸的重组蛋白(包括在天然抗菌肽序列末端添加1～5个aa的肽段)，但这类抗菌重组蛋白仅验证了在温和生理条件下的活性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用，经毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白具有在羊等反刍动物的消化道生理环境下发挥较强的抑菌效果的潜力。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、一种羊源耐酸重组抗菌肽，该耐酸重组抗菌肽包括重组绵羊β防御素2蛋白。

4、优选的，所述耐酸重组抗菌肽还包括与重组绵羊β防御素2蛋白融合表达的柔性接头肽段。

5、优选的，所述重组绵羊β防御素2蛋白的氨基酸序列如seq.id.no.1所示，氨基酸序列大小为64aa。

6、优选的，所述柔性接头肽段连接在重组绵羊β防御素2蛋白羧基端，柔性接头肽段的氨基酸序列为ggggs。

7、优选的，所述耐酸重组抗菌肽还包括融合表达的his标签(例如，6×his)，his标签通过柔性接头肽段连接在重组绵羊β防御素2蛋白的羧基端(也就是说，与重组绵羊β防御素2蛋白融合表达的柔性接头肽段及his标签的氨基酸序列可以为ggggshhhhhh)。

8、上述羊源耐酸重组抗菌肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

9、采用基于毕赤酵母构建的表达系统，将所述耐酸重组抗菌肽进行真核表达。

10、优选的，所述制备方法具体包括以下步骤：

11、1)根据绵羊β防御素2基因获得对应的cds，根据绵羊β防御素2基因的cds与柔性接头肽段及his标签对应的核苷酸序列构建含有目的基因(即上述重组绵羊β防御素2蛋白的氨基酸序列所对应的核苷酸序列)的重组载体，利用该重组载体构建用于表达所述耐酸重组抗菌肽的毕赤酵母表达菌株，即所述耐酸重组抗菌肽可以采用如seq.id.no.3所示的氨基酸序列，氨基酸序列大小为75aa(为含有目的蛋白与his标签的氨基酸序列的融合序列)；

12、2)对所述毕赤酵母表达菌株连续发酵培养后分离去除菌体(即除菌)，得到含有所述耐酸重组抗菌肽的发酵液上清。

13、优选的，所述毕赤酵母表达菌株的构建中采用巴斯德毕赤酵母菌gs115株作为所述重组载体的真核宿主。

14、优选的，所述重组载体是通过将含有目的基因的核苷酸序列(例如，seq.id.no.2所示的与所述耐酸重组抗菌肽对应的基因序列)与诱导分泌型毕赤酵母表达载体(例如，ppic9k)骨架连接所得。

15、优选的，所述毕赤酵母表达菌株是通过对含有所述重组载体的毕赤酵母转化子进行抗性压力筛选(例如，采用高浓度抗生素g418)所得。

16、一种抗菌添加剂，该添加剂含有上述羊源耐酸重组抗菌肽，所述添加剂的具体形式可以为上述毕赤酵母表达菌株的发酵液上清。

17、一种羊饲料，该饲料含有上述羊源耐酸重组抗菌肽，所述饲料可以通过将上述抗菌添加剂加入羊(例如，山羊、绵羊)日常饲粮或其他种类饲粮中制成。

18、上述羊源耐酸重组抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

19、优选的，所述耐酸重组抗菌肽对致病性大肠杆菌具有抑制作用。

20、优选的，所述耐酸重组抗菌肽的生物学活性验证包括对羊源致病菌进行牛津杯抑菌实验，即采用牛津杯法测定抑菌圈的大小，从而判定所述耐酸重组抗菌肽(或目的蛋白)的抑菌活性。

21、优选的，在进行牛津杯抑菌实验前，利用体外模拟羊皱胃胃酸环境(羊皱胃胃酸ph在1.05～1.32之间)处理所述耐酸重组抗菌肽。

22、本发明的有益效果体现在：

23、本发明根据绵羊β防御素2进行抗菌重组蛋白表达设计，经毕赤酵母真核表达后通过活性检测发现，抗菌重组蛋白(实际指重组绵羊β防御素2蛋白)具有较强的抑菌效果，并且制备操作简单，方便进行制剂应用(例如，只需对发酵液上清除菌即可分离出高活性蛋白)。本发明获得的重组绵羊β防御素2蛋白在开发新型替抗产品以及羊饲用抗菌肽中具有广泛应用前景。

24、进一步的，本发明通过在重组绵羊β防御素2蛋白羧基端设计用于连接his标签的柔性接头肽段，不仅可以使得重组绵羊β防御素2蛋白更易被检测鉴定及后期纯化，而且经酸化处理条件下的抑菌实验结果证实，利用毕赤酵母表达系统(具体指上述毕赤酵母表达菌株)可以获得具备优异耐酸性能的重组绵羊β防御素2蛋白融合表达产物，从而可以作为一种外源性的耐酸抑菌制剂(例如，上述毕赤酵母表达菌株的发酵液上清)在反刍动物(例如，羊)饲料添加剂中应用。

技术特征：

1.一种耐酸重组抗菌肽，其特征在于：该重组抗菌肽包括重组绵羊β防御素2蛋白。

2.根据权利要求1所述一种耐酸重组抗菌肽，其特征在于：所述重组抗菌肽还包括与重组绵羊β防御素2蛋白融合表达的柔性接头肽段。

3.根据权利要求2所述一种耐酸重组抗菌肽，其特征在于：所述重组绵羊β防御素2蛋白的氨基酸序列如seq.id.no.1所示。

4.根据权利要求2所述一种耐酸重组抗菌肽，其特征在于：所述柔性接头肽段连接在重组绵羊β防御素2蛋白羧基端，柔性接头肽段的氨基酸序列为ggggs。

5.一种耐酸重组抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述一种耐酸重组抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括以下步骤：

7.一种抗菌添加剂，其特征在于：该添加剂含有如权利要求1～4中任意一项所述的耐酸重组抗菌肽。

8.一种羊饲料，其特征在于；该饲料含有如权利要求1～4中任意一项所述的耐酸重组抗菌肽。

9.一种如权利要求1～4中任意一项所述的耐酸重组抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述重组抗菌肽对致病性大肠杆菌具有抑制作用。

技术总结
本发明公开了一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用。将根据绵羊β防御素2基因CDS设计的重组绵羊β防御素2基因整合到巴斯德毕赤酵母GS115基因组上，从而实现目的基因在毕赤酵母上的分泌表达。本发明通过毕赤酵母真核表达的重组绵羊β防御素2蛋白具有较强的抑菌效果，在开发新型替抗产品以及羊饲用抗菌肽中具有广泛应用前景。

技术研发人员：齐雪峰,仇鹏飞,李显
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4