一种洋甘菊β-榄香烯合成酶基因McTPS5及其应用

本发明涉及植物基因工程。更具体地，涉及一种洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5及其应用。

背景技术：

1、洋甘菊(matricaria chamomilla l.)是菊科母菊属一年生草本植物，原产于英国，现分布于欧洲、亚洲北部和西部，在我国的西部和北部种植广泛。洋甘菊不仅具有较高的观赏价值，同时也是一种重要的芳香药用植物，具有消炎、抑菌、抗过敏等功效；其中，以萜烯类化合物为主要的活性成分。萜类化合物是植物中最主要的挥发性化合物，迄今为止，已在植物中检测到超过25000种萜类化合物。而根据c5异戊二烯烃单位，萜类化合物分为半萜(c5)、单萜(c10)、倍半萜(c15)、二萜(c20)、三萜(c30)和四萜(c40)等。

2、萜类合成酶基因(tps)是萜类化合物合成途径的关键结构基因之一，它们可以催化不同的底物gpp、fpp和ggpp形成相应的单萜、倍半萜和二萜等。其中，β-榄香烯是一种重要的倍半萜化合物，也是一种重要的抗癌药物，具有抑制肿瘤细胞增值、诱导肿瘤细胞凋亡等疗效。β-榄香烯通常是从中国传统中药姜科植物温郁金(温莪术)中分离提取得到，然而由于该植物培养周期长，受环境影响大，且提取物中含有多种同分异构体，严重制约了β-榄香烯的稳定供应；且现有研究中也鲜有其他植物来源的β-榄香烯的研究报道。因此，亟需开发更多的、不同植物来源的、能高效生产β-榄香烯的方法。

3、目前，国内对洋甘菊萜类合成酶的研究主要集中在洋甘菊倍半萜合成酶基因上，如在洋甘菊mcgds1基因可催化fpp生成法尼烯；mcgds3则可以催化fpp生成大根香叶烯a，mcgds2与fpp反应生成大根香叶烯d(ling et al.,2020)，mcbbs与fpp反应生成α-红没药醇(郭春晓，2018)等，但对洋甘菊在β-榄香烯合成方面还未见研究。因此，为了更加全面阐述洋甘菊β-榄香烯成分形成和调控机理，同时为β-榄香烯的制备提供一种新的生物工程方法，有必要对洋甘菊β-榄香烯成分形成机理进行研究。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服洋甘菊倍半萜类β-榄香烯研究存在的不足，提供一种洋甘菊中控制倍半萜成分β-榄香烯的单功能酶基因mctps5及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5。

3、本发明的第二个目的是提供一种洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5。

4、本发明的第三个目的是提供所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5和/或洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种重组载体和包含重组载体的重组菌以及包含重组菌的细胞系。

6、本发明的第五个目的是提供一种制备β-榄香烯的方法。

7、本发明的第六个目的是提供一种含β-榄香烯的转基因材料的构建方法。

8、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

9、本发明在洋甘菊管状花中克隆得到一个长为1704bp的洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5，mctps5基因的全长cdna序列如seq id no:1所示，mctps5基因编码区(cds)共1680bp，其核苷酸序列如seq id no:2所示；推测编码559个氨基酸，其氨基酸序列如seq idno:3所示，推测蛋白分子量为64.52kda，等电点(pi)为4.80，基因序列包含ddxxd保守序列。

10、本发明研究显示洋甘菊基因mctps5在洋甘菊管状花中表达量较高，与β-榄香烯在管状花中的表达量呈正相关，且mctps5基因编码生成的酶是一种可以催化fpp生成倍半萜类物质β-榄香烯的功能酶基因，可利用洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5通过微生物代谢工程来制备β-榄香烯，进而可以用于制备植物精油或药物。同时，将mctps5连接到植物转化载体中，然后导入洋甘菊或其它植物中，可获得表达mctps5基因的转基因植株，有助于培育β-榄香烯植物或构建含有倍半萜β-榄香烯合成酶基因的转基因材料。

11、根据本发明提供的mctps5基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与mctps5等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以mctps5基因片段为探针筛选洋甘菊或其它植物的基因组文库或cdna文库获得；(3)根据mctps5基因序列信息设计寡核苷酸引物，用pcr扩增的方法从洋甘菊或其它植物的基因组、mrna和cdna中获取；(4)在mctps5基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

12、因此，本发明提供洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5或洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5在制备β-榄香烯、在β-榄香烯植物育种、或在构建含β-榄香烯的转基因材料中的应用。

13、特别地，本发明提供洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5或洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5用于β-榄香烯植物育种中的应用，首先，是在选育β-榄香烯植物中的应用，通过检测植物体内是否含有基因mctps5或β-榄香烯合成酶mctps5，从而鉴定该植物是否含有β-榄香烯；其次，是在培育含β-榄香烯植物中的应用，通过促进植物中mctps5基因的表达，从而提高植物体内β-榄香烯的含量。

14、本发明提供一种重组载体，包含洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5。

15、本发明提供一种重组菌，包含所述重组载体。

16、本发明提供一种细胞系，包含所述重组菌。

17、本发明本发明提供一种制备β-榄香烯的方法，以法尼基焦磷酸fpp为底物，采用洋甘菊倍半萜合成酶mctps5或其重组蛋白进行催化制备β-榄香烯。

18、本发明还提供一种含有β-榄香烯的转基因材料的构建方法，将洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5转入植物表达载体中，通过外源转化植物材料，从而获得含有β-榄香烯的转基因材料。

19、本发明具有以下有益效果：

20、本发明提供了一种洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5，该基因在洋甘菊管状花中表达量较高，与β-榄香烯在管状花中的表达量呈正相关，并且可以催化fpp生成倍半萜类化合物β-榄香烯，通过促进植物mctps5的表达，从而提高植物萜类成分含量，用于β-榄香烯植物育种；还可利用含β-榄香烯合成酶mctps5的重组蛋白于体外制备β-榄香烯，进一步用于后续产品的开发及制备，如制备精油、香精和药物等。同时，将mctps5基因片段构建在植物表达载体上，通过外源转化其他植物材料，能够获得含有β-榄香烯合成酶基因的转基因材料，对培育药用植物提供了一种有效的方法。

21、另外，本发明能够进一步提供或应用利用mctps5基因片段获得的具有药用价值的转基因植株和相应的种子，以及过表达mctps5基因或基于该基因的重组体转化的植株、或由这类植株获得的种子等进行β-榄香烯植物育种，也可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。

技术特征：

1.一种洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5，其特征在于，所述基因的全长cdna序列如seq id no:1所示，基因编码序列如seq id no:2所示。

2.一种洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5，其特征在于，所述合成酶的氨基酸序列如seqid no:3所示。

3.权利要求1所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5或权利要求2所述洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5在制备β-榄香烯中的应用。

4.权利要求1所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5或权利要求2所述洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5在β-榄香烯植物育种中的应用。

5.权利要求1所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5或权利要求2所述洋甘菊β-榄香烯合成酶mctps5在构建含β-榄香烯的转基因材料中的应用。

6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5。

7.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求6所述重组载体。

8.一种细胞系，其特征在于，包含权利要求7所述重组菌。

9.一种制备β-榄香烯的方法，其特征在于，以法尼基焦磷酸fpp为底物，采用权利要求2所述洋甘菊倍半萜合成酶mctps5或其重组蛋白进行催化制备β-榄香烯。

10.一种含β-榄香烯的转基因材料的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述洋甘菊β-榄香烯合成酶基因mctps5转入植物表达载体中，通过外源转化植物材料，从而获得含有β-榄香烯的转基因材料。

技术总结
本发明公开了一种洋甘菊β‑榄香烯合成酶基因McTPS5及其应用。本发明在洋甘菊中克隆得到β‑榄香烯合成酶基因McTPS5，该基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过制备McTPS5基因外源重组蛋白，在催化底物中反应后可以生成倍半萜β‑榄香烯，可用于制备β‑榄香烯；同时，将McTPS5转入植物表达载体中，通过外源转化植物材料，可用于培育β‑榄香烯植物或构建含有倍半萜β‑榄香烯合成酶基因的转基因材料。

技术研发人员：余让才,李代毫,范燕萍
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21