一种玉米基因编辑方法

本发明属于基因工程和转基因，具体涉及一种玉米基因编辑方法。

背景技术：

1、碱基编辑器(base editor)能够在基因组中产生单碱基的突变，可以用于对物种的基因组进行精准的修改，从而改变基因功能、产生新的性状。碱基编辑器主要包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(abe)，它们在基因编辑中已经有了成功的应用。

2、最近，人们发现了一类新的碱基编辑器aybe，它是将n-甲基嘌呤dna糖基酶(n-methylpurine dna glycosylase，mpg)与abe融合而成，能够在哺乳动物细胞中产生a到t和a到c的碱基突变(aybe)(tong h,wang x,liu y,et al.programmable a-to-y baseediting by fusing an adenine base editor with an n-methylpurinednaglycosylase[j].nat biotechnol,2023,41(8):1080-1084.)。也有研究者在植物的水稻中尝试使用了aybe，发现它在水稻中可以产生a到t的碱基突变(akbe)(li y,li s,li c,et al.engineering a plant a-to-k base editor with improved performance byfusion with a transactivation module[j].plant commun,2023:100667；wu x,ren b,liu l,et al.adenine base editor incorporating the n-methylpurinednaglycosylase mpgv3 enables efficient a-to-k base editing in rice[j].plantcommun,2023:100668.)。

3、玉米作为重要的作物类别，其基因组结构相对复杂，基因编辑操作比水稻要困难，因此在玉米中成功使用aybe的策略进行单碱基编辑需要克服一些特定的技术障碍。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明使用mpg蛋白和玉米polη蛋白改造abe腺嘌呤单碱基编辑载体，并测试了多个玉米不同种质的polη，获得了一个a到y编辑效果最好的编辑载体，可以用于在玉米中对特定基因组位点进行单碱基编辑。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种蛋白组合，其特征在于，所述蛋白组合由tada8e-ncas9-mpg融合蛋白和玉米polη蛋白组成。其中tada8e-ncas9-mpg蛋白序列如seq id no.9所示，polη蛋白序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供一种基因编辑系统，其特征在于，包含如下组分：

5、1)上述的蛋白组合；

6、2)指导rna，该指导rna能够与玉米基因组靶序列杂交，并与tada8e-ncas9-mpg融合蛋白结合。

7、指导rna包括靶向基因组靶序列的20bp左右的指导序列，crrna和tracrrna，crrna和tracrrna能够结合cas9蛋白并指导其识别基因组上的pam序列。其中crrna和tracrrna序列如seq id no.14所示。

8、本发明还提供一种构建体，其特征在于，所述构建体能够在玉米中产生上述的基因编辑系统。

9、在一些实施方案中，上述构建体由以下(1)～(8)元件依次连接而成：

10、(1)fmv；(2)编码玉米polη蛋白的核酸分子；(3)pinii；(4)zmu6；(5)指导rna；(6)玉米泛素基因启动子；(7)编码mpg蛋白的核酸分子；(8)nos终止子。

11、其中，上述(1)～(8)元件的核酸序列分别如seq id no.10～17所示。

12、本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有上述的构建体，或能够产生上述的基因编辑系统。

13、在一些实施方案中，上述宿主细胞为细菌宿主细胞和/或不可再生的植物宿主细胞。

14、在一些实施方案中，上述细菌宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞；所述不可再生的植物为玉米。

15、本发明还提供上述蛋白组合、基因编辑系统、构建体、宿主细胞在玉米基因编辑中的应用。

16、在一些实施方案中，上述的玉米基因编辑为将a突变为c或t。

17、本发明的优点及有益效果如下：由于玉米基因组结构的复杂性和遗传转化的难度，常规腺嘌呤单碱基编辑载体的编辑效率太低。本发明使用mpg蛋白和玉米polη蛋白改造abe腺嘌呤单碱基编辑载体，并测试了多个玉米不同种质的polη，获得了一个a到y编辑效果最好的编辑载体，可以用于在玉米中对特定基因组位点进行单碱基编辑。

1.蛋白组合，其特征在于，所述蛋白组合由seq id no.1和seq id no.9所示序列的蛋白组成。

2.基因编辑系统，其特征在于，包含如下组分：

3.构建体，其特征在于，所述构建体能够在玉米中产生权利要求2所述的基因编辑系统。

4.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于，所述构建体由以下(1)～(8)元件依次连接而成：

5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3-4所述的构建体，或能够产生权利要求2所述的基因编辑系统。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌宿主细胞和/或不可再生的植物宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细菌宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞；所述不可再生的植物为玉米。

8.权利要求1所述的蛋白组合，或权利要求2所述的基因编辑系统，或权利要求3-4所述的构建体，或权利要求5-7所述的宿主细胞在玉米基因编辑中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的玉米基因编辑为将a突变为c或t。