用于产肠毒素大肠杆菌K99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用

本发明属于生物基因工程，具体涉及用于产肠毒素大肠杆菌k99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用。

背景技术：

1、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic escherichia coli,etec)是一种能够引起人和多种动物腹泻的致病性大肠杆菌。本病多发于幼龄动物，在猪群中主要导致7日龄以内仔猪发生剧烈腹泻和脱水，传播迅速，发病率和死亡率均较高，称为仔猪黄痢；10-30日龄仔猪多发白痢，病死率不高，但导致仔猪发育不良，逐渐消瘦，甚至造成僵猪的情况，给养殖场造成巨大经济损失，因此，研究和创制针对该病的疫苗具有重要意义(张凡庆2022)。

2、活载体疫苗是将目的抗原编码基因通过分子生物学手段导入活载体(无或弱毒的细菌或病毒)，构建重组菌(毒)株，使目的基因随着重组菌(毒)株在宿主体内的增殖而大量表达,从而诱发相应的免疫保护应答。乳酸乳球菌(lactococcus lactic)是乳酸菌的典型菌种之一，具有生长迅速、易于操作及安全无毒等优点，目前已获得其全部基因组序列，逐渐成为表达外源蛋白和作为活载体疫苗载体的理想选择(王琛2019)。然而，乳酸菌具有较高的生物学与遗传基因型多样性，不同外源基因的表达量差异较大甚至不表达，相同基因在不同宿主菌中表达水平也有所差异，刺激机体产生的细胞免疫和体液免疫水平也不同，抗原在重组菌株表面展示的量同样存在较大的差异，而蛋白表达量是载体疫苗发挥效果的关键因素，因而在实际使用过程中，免疫动物收获的效果也参差不齐，这也是乳酸菌载体疫苗发展的难点之一(刘琼等2019)。

3、目前养猪业对于etec的防控主要还是用抗生素进行治疗，而临床分离的大肠杆菌普遍耐药，应用抗生素有时不仅达不到治疗效果，反而使多重耐药菌株增加，加之世界各国限抗禁抗政策的不断落实，抗生素治疗的方案已经不满足当前本病的防控，因而接种疫苗是预防本病的最佳方法(杨德鸿等2019)。etec疫苗的研究距今已逾30年，从单纯的物理化学手段到基因工程手段均取得了一系列的进展，但至今尚无一种疫苗能有效地适用于各个地区，大多数疫苗的研究都由于免疫原性不佳或是缺乏广泛保护力而停滞不前(张恒慧等2015)。全菌灭活疫苗是目前试验性及商品化etec疫苗的主要制备方法，但是由于etec血清型众多，且分布呈地域差异性，实际使用过程中地域局限性大，广谱保护效果差；同时存在有效成分占比不高，免疫剂量大，不具有疫苗的高效性、内毒素和无关成分含量较高，副反应严重等问题，导致疫苗在临床中使用效果并不理想。基因工程疫苗同样已有相关产品获批进入临床使用，但是由于蛋白的表达会相互影响，不能完全发挥抗原的全部效果、在临床应用中不能保护一些非菌毛黏附素毒株、试验效果较好而实际应用效果不佳等问题导致临床使用率并不高。

4、针对本病的亚单位疫苗一直以来是备受关注的疫苗类型，其具有广谱性强，免疫原性高，动物应激反应小等优点，但是由于细菌本身抗原蛋白制备较为困难，存在菌株表达量低、不易获得大量可溶性蛋白、提纯成本较高、免疫效果达不到预期等问题，目前为止还没有产品在临床使用。弱毒活疫苗存在毒力返强风险，并且往往只对同源菌株有效，加之全世界对细菌弱毒苗研究较少等，目前也没有疫苗可供使用(夏芃芃等2016；杨德鸿等2019；bourgeois et al.2016)。因此，当前对于etec的防控，仍急需一种行之有效的疫苗方案。

5、针对上述问题，本发明提供了用于产肠毒素大肠杆菌k99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗，该疫苗通过口服免疫方式进行免疫，避免了疫苗注射带来的应激反应，同时极大的发挥了黏膜免疫的效果，抵抗大肠杆菌病的感染。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物为分别表达seq id no.2，seq id no.4和seq id no.6的乳酸乳球菌nz3900。

2、本发明的另一个目的在于提供了上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

4、一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达seq id no.2的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，表达seq id no.的4重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm和表达seq id no.6的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm。

5、以上所述的方案，优选的，所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，是将seq id no.1所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。

6、所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm是将seqid no.3所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。

7、所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm是将seqid no.5所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得。

8、以上所述的方案，优选的，三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1～2：1～2：1～2。

9、本发明的保护范围还包括：上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。优选的，所述的产肠毒素大肠杆菌的菌毛型为k99。

10、与现有技术相比，本发明的有益效果：

11、1.本发明首次提供了可口服的产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichia coli,ete c)，利用该疫苗小鼠免疫攻毒实验，7天日观察疫苗的保护率可以达到100％，仔猪免疫后攻毒发现能够全部保护不发生腹泻。

12、2.本发明专门针对乳酸乳球菌nz3900，设计的产肠毒素大肠杆菌抗原展示序列，该序列可在乳酸乳球菌nz3900这一展示载体上大量而稳定的表达，同时动物服用后达到良好的免疫效果。

13、3.本发明由于是口服疫苗，免疫方式简单，口服拌料容易规模化实施，避免注射引起的应激反应，可以有效的预防仔猪黄白痢的发生。

技术特征：

1. 一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达seq id no.2的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，表达seq id no. 4重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-stb-acm和表达seq id no.6的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-fanc-acm。

2. 根据权利要求1的混合物，其特征在于：所述的重组乳酸乳球菌r-l.lactis--nz3900-pnz8149-usp45-sta-acm，是将seq id no.1所示基因导入乳酸乳球菌nz3900获得；

3.根据权利要求1所述的混合物，所述的三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1~2：1~2：1~2。

4.权利要求1所述的乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的产肠毒素大肠杆菌的菌毛型为k99。

技术总结
本发明属于生物基因工程技术领域，公开了用于产肠毒素大肠杆菌K99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用。本发明制备了3个乳酸乳球菌抗原表面展示株，混合后进行口服免疫。口服免疫方式操作方便，避免了注射免疫对动物造成的应激反应，同时免疫效果得到了极大的提升，可以有效预防产肠毒素大肠杆菌对仔猪造成的腹泻。本发明是一款口服的大肠杆菌疫苗，小鼠免疫攻毒实验表明，可以在LD50的攻毒剂量下保持全部存活，仔猪免疫攻毒实验表明，可以100%保护仔猪的腹泻情况，表明免疫组产生了有效的黏膜免疫保护能力。

技术研发人员：王湘如,于江旭,付霁阳,刘洪硕,金言成,吴姝璇,陈焕春
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25