一种通过真菌精准激活的CAR-T细胞、制备方法、应用及药物组合物

本发明属于生物医药领域，涉及一种car-t细胞，尤其涉及一种通过真菌精准激活的car-t细胞、制备方法、应用及药物组合物。

背景技术：

1、近年来，免疫疗法在肿瘤治疗中占据了越来越重要的地位。其中，嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，car-t)免疫疗法在血液性肿瘤中得到了广泛应用并逐渐向实体瘤领域发展。嵌合抗原受体（car）基因包括肿瘤抗原相对应的抗体的抗原结合部分（scfv）与cd3-ζ链或fcεriγ的胞内段。car-t细胞是通过将car基因转染入患者的t细胞，使患者自身的t细胞能够表达肿瘤特异性的car，从而清除肿瘤细胞。

2、car-t细胞的数量是影响car-t疗效的决定性因素，效应car-t细胞的数量越多，杀伤肿瘤细胞的效果越好。但是，回输体内的car-t细胞受到肿瘤微环境等抑制因素的影响，迅速耗竭衰老，car-t细胞的数量难以维持治疗所需。因此，增加体内、特别是肿瘤内car-t细胞的数量，是进一步提高car-t疗效的关键。

3、目前，car-t细胞的扩增主要是通过细胞因子刺激，但基因改造后仅有部分t细胞表达car，不表达car的t细胞在非特异性刺激下甚至增殖得更快，从而导致基因改造效率进一步降低。近年来研发的纳米人工抗原递呈细胞（aapc）为car-t细胞提供了活化必须的第一&二信号，但由于该纳米材料的生物相容性欠佳，至今仍未被批准用于人体。因此，在免疫细胞治疗领域，亟需一种生物相容性好的、能够在体内外特异性扩增car-t细胞状态的新方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞、制备方法、应用及药物组合物，以克服现有技术的缺陷。

2、为实现上述目的，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，具有这样的特征：包括两个抗原识别域；第一个抗原识别域是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供car-t细胞活化的专有信号；第二个抗原识别域是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动car-t细胞杀伤肿瘤细胞；第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。

3、进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是真菌细胞壁成分或通过酵母菌展示技术外接的抗原。其中，通过酵母菌展示技术外接的抗原包括但不限于fitc和ova等模式抗原。

4、进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述真菌表面抗原的单链抗体中的真菌表面抗原是β-葡聚糖或甘露糖。

5、进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述肿瘤表面抗原的单链抗体中的肿瘤表面抗原是her2、egfrⅷ、cea或gucy2c。

6、进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述car-t细胞的序列由β葡聚糖单链可变区、her2单链可变区、cd8a铰链区、cd28跨膜区和胞内区、41bb胞内区以及cd3ζ胞内区串联构成。

7、进一步，本发明提供一种通过真菌精准激活的car-t细胞，还可以具有这样的特征：其中，所述β葡聚糖单链可变区包含seq id no:1所示的vh1序列和seq id no:2所示的vl1序列；所述her2单链可变区包含seq id no:3所示的vh2序列和seq id no:4所示的vl2序列。

8、本发明还提供上述通过真菌精准激活的car-t细胞的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：步骤一、设计car-t细胞质粒；步骤二、通过步骤一的质粒进行包装慢病毒；步骤三、分离原代t细胞；步骤四、磁珠分选步骤三得到的原代t细胞；步骤五、通过步骤二获得的病毒转染步骤四获得的t细胞，得到car-t细胞。

9、本发明还提供上述通过真菌精准激活的car-t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10、本发明还提供一种治疗肿瘤的药物组合物，具有这样的特征：包括上述通过真菌精准激活的car-t细胞和真菌；所述真菌与car-t细胞中真菌表面抗原的单链抗体中的真菌为同一种真菌。

11、本发明还提供上述药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

12、本发明的有益效果在于：

13、本发明car-t细胞有两个抗原识别域，第一部分是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供car-t细胞活化的专有信号；第二部分是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动car-t细胞杀伤肿瘤细胞。两部分之间信号串联，且第一部分真菌激活域在上游。没有真菌存在时，第二部分识别肿瘤后，可将信号传导至胞内，启动杀伤信号，所以该car-t细胞的杀伤不依赖于真菌；当真菌存在时，第一部分真菌激活域在上游提供一个额外的扩增信号，特异性扩增car-t细胞。

14、本发明car-t细胞及其药物组合物提供了肿瘤治疗性真菌的开发与新应用。具体的，工程化细菌已被广泛用于改善肠道微生态、提高肿瘤免疫原性，但是工程化真菌的研究尚处于起步阶段。与工程化细菌相比，工程化真菌具有完整的细胞结构，可作为car-t的靶细胞。将真菌作为car-t的饲养细胞，以刺激car-t细胞在体内外特异性扩增，国内外尚无相关研究。本发明采用酵母菌等真菌的优势在于：在肿瘤局部提供car-t特异性扩增的专有信号；该工程化真菌可通过招募免疫细胞浸润肿瘤，进一步增强抗肿瘤免疫的疗效；该工程化布拉迪酵母菌稳定性好，耐酸性强，可通过口服/肛塞给药；该策略生物相容性好，临床转化能力强，有望大规模推广应用。

15、本发明car-t细胞及其药物组合物提供了car-t细胞特异性扩增的全新策略。具体的，目前car-t的扩增方法大多属于非特异性扩增，且以体外扩增为主。亟需研发新的策略，解决car-t细胞难扩增、易耗竭的问题。本发明将car-t细胞免疫治疗的需求与工程化真菌的特点有机结合，着眼于解决car-t疗法中存在的实际且迫切的问题，提出用工程化真菌在体内外特异性扩增car-t细胞。该新型car-t细胞的优势在于：在体内外均能获得特异性扩增的专有信号，car-t细胞产率大幅提升；具有第四代car-t的特点，但car的质粒大小仅为10kb左右，避免因为过于复杂导致基因转染错误；本发明具有普适性，不局限于her2阳性的肠癌。

技术特征：

1.一种通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

4.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

5.根据权利要求1所述的通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的通过真菌精准激活的car-t细胞，其特征在于：

7.如权利要求1~6任意一项所述的通过真菌精准激活的car-t细胞的制备方法，其特征在于：

8.如权利要求1~6任意一项所述的通过真菌精准激活的car-t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

9.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：

10.如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种通过真菌精准激活的CAR‑T细胞、制备方法、应用及药物组合物，属于生物医药领域，CAR‑T细胞包括两个抗原识别域；第一个抗原识别域是真菌表面抗原的单链抗体，识别真菌，提供CAR‑T细胞活化的专有信号；第二个抗原识别域是肿瘤表面抗原的单链抗体，启动CAR‑T细胞杀伤肿瘤细胞；第一个抗原识别域与第二个抗原识别域之间信号串联，且第一个抗原识别域在上游。本发明具有特异性扩增、治疗肿瘤等优点。

技术研发人员：王婷婷,王欣玥,潘心怡,任政乾,郑耀军
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15