一种富集短片段DNA文库的方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种富集短片段dna文库的方法及其应用。

背景技术：

1、血浆游离dna(cfdna)一般是指细胞发生凋亡、主动释放或细胞坏死释放到血液循环系统中的dna片段。1997年，卢煜明教授发现孕妇外周血血浆中存在胎儿游离dna。结合高通量测序技术的快速发展，已经开发出采集孕妇外周血用于非侵入性产前胎儿染色体异常检测(nipt)、产前亲子鉴定(nippt)等多种用途。nipt是指通过高通量测序检测cfd na中染色体非整倍体数目来检测胎儿是否存在染色体疾病(13三体综合症、18三体综合症及21三体综合症)。nippt是指通过抽取母体静脉血及疑父静脉血进行高通量测序分析，比对母体静脉血中所含的胎儿dna(cffdna)及疑父的cfdna的遗传位点信息从而鉴定亲缘关系。进一步的研究发现，肿瘤细胞也会释放cfdna进入血液中，称为循环肿瘤dna(ctdn a)，通过cfdna分析可以实现肿瘤的检测和监测。

2、孕妇外周血中提取的游离dna多数来自母体，胎儿dna仅占总游离dna 5％-30％。数据显示有2-5％的孕妇胎儿浓度偏低，低胎儿游离dna占比与检测失败和假阴性结果有关。解决母源dna背景高，胎儿游离dna含量低的问题，可以提高胎儿dna相关检测的成功率。同样地，血浆中肿瘤ctdna的含量低导致从液体活检样本中检测肿瘤信号具有很大的挑战性。文献报道，胎儿cfdna或肿瘤ctdna比正常来源的cfdna的片段长度短。正常来源cfdna长度分布呈现一个168bp左右的主条带，而胎儿cfdna或肿瘤ctdna则富含小于160bp的短片段，可以通过筛选短片段cfdna来富集胎儿cfdna或肿瘤ctdna。

3、目前胎儿dna富集常见方法有甲基化敏感的限制性酶切(msre酶切)以及磁珠分选短片段法。msre酶切消化母亲来源的cfdna，再进行pcr扩增，可以达到富集胎儿cfd na的目的。但是此方法只能用于少数部分胎儿高甲基化区域的cfdna的富集，适合于qp cr检测，不能用于高通量测序分析。磁珠分选短片段方法可以富集胎儿全基因cfdna，但是此方法富集效率低、样本间重复性较差，且在富集过程中dna回收效果差，造成文库损失较大，所以数据利用率低，不能广泛地应用于短片段dna的富集。

4、因此，需要开发出一种简单、有效，适用于更多短片段游离dna富集的方法，来提高无创产前基因检测的准确性和肿瘤基因检测的可靠性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可以实现血浆中短片段dna富集的方法，以解决现有技术中胎儿dna浓度低从而导致的无创产前基因检测灵敏度低的问题，以及产前亲子鉴定中孕早期的胎儿dna占比低，导致的无法在更早的孕周期内检测出亲缘关系的问题。

2、本发明主要考虑的是提高文库中胎儿dna浓度，可在提取的游离dna文库构建完成后通过低熔点琼脂糖胶进行分离，特异性地分离出短片段dna，扩增纯化后可进行高通量测序。

3、为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

4、一种富集短片段核酸文库的方法，所述方法为：将构建好的dna文库通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收短片段dna，然后通过pcr扩增切胶回收产物并进行磁珠纯化，得到富集后的短片段dna文库。该技术旨在通过电泳分离出短片段dna，通过高保真聚合酶特异性扩增回收的短片段dna，最后通过高通量测序分析短片段dna浓度及占比。

5、进一步的，所述短片段dna为50bp～160bp的dna(不包括接头长度)。

6、优选的，所述低熔点琼脂糖凝胶的使用浓度为1％～3％。

7、优选的，所述低熔点琼脂糖凝胶的使用浓度为1％、1.5％、2％、2.5％或3％。

8、进一步的，dna文库的构建步骤依次为：样品准备、末端修复、接头连接、接头连接产物纯化、文库扩增，所述样品准备步骤为：采集受试者血液或血浆，进行cfdna提取。

9、优选的，构建文库中接头连接方法包括y型短接头连接或y型长接头连接方法。

10、作为一些具体的应用方式，本发明的富集方法可用于胎儿无创产前基因检测或肿瘤基因检测试剂盒中。

11、进一步的，所述产前基因检测包括无创产前亲子鉴定或无创产前染色体异常检测。

12、作为一种具体的实施方式，本发明提供了一种用于富集胎儿短片段核酸文库的试剂盒，包括：提取孕妇cfdna的试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、产物纯化试剂、pcr扩增试剂、低熔点琼脂糖凝胶电泳试剂、胶回收试剂。

13、本发明达到的技术效果：

14、现阶段游离dna的检测已涉及到多个方面，包括无创产前亲子鉴定、无创产前胎儿染色体异常检测及癌症基因检测等。由于胎儿dna浓度低使得产前鉴定大都在7周才可以抽取孕妇静脉血进行检测，测序分析结果也不够精准。同样地，血浆中肿瘤ctdna的含量低导致从液体活检样本中检测肿瘤信号具有很大的挑战性。本发明方法将二代测序中构建完成的dna文库通过低熔点琼脂糖凝胶电泳进行分离，切胶回收短片段dna并扩增即可得短片段富集dna文库。后续通过高通量测序即可分析短片段富集的胎儿基因或肿瘤相关基因。与现有常见的磁珠分选方法相比，本发明方法操作步骤简单，无需额外操作步骤，不会对dna造成损伤；且富集效果优秀，使得富集胎儿游离dna浓度提高2-3倍，可有效提高无创产前基因检测的准确性。

技术特征：

1.一种富集短片段核酸文库的方法，其特征在于，所述方法为：将构建好的dna文库通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收短片段dna，然后通过pcr扩增切胶回收产物并进行磁珠纯化，得到富集后的短片段dna文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短片段dna为50bp～160bp的dna，不包括接头长度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低熔点琼脂糖凝胶的使用浓度为1％～3％。

4.根据权利要求3所述的方法，所述低熔点琼脂糖凝胶的使用浓度为1％、1.5％、2％、2.5％或3％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，dna文库的构建步骤依次为：样品准备、末端修复、接头连接、接头连接产物纯化、文库扩增，所述样品准备步骤为：采集受试者血液或血浆，进行cfdna提取。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，接头连接方法包括短接头连接或长接头连接方法。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法在胎儿无创产前基因检测或肿瘤基因检测试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产前基因检测包括无创产前亲子鉴定或无创产前染色体异常检测。

9.一种用于富集胎儿短片段核酸文库的试剂盒，其特征在于，包括：提取cfdna的试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、产物纯化试剂、pcr扩增试剂、低熔点琼脂糖凝胶电泳试剂和胶回收试剂。

技术总结
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体公开一种富集短片段DNA文库的方法及其应用，具体方法为：将构建好的DNA文库通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收短片段DNA，然后通过PCR扩增切胶回收产物并进行磁珠纯化，得到富集后的短片段DNA文库用于高通量测序。本发明在胎儿游离DNA富集的检测中，与现有的磁珠分选、甲基化敏感的限制性酶切富集方法等相比，操作步骤简单，无需额外操作步骤，不会对DNA造成损伤；且富集效果优秀，使得富集胎儿游离DNA浓度提高2‑3倍，可有效提高无创产前基因检测或其它胎儿游离DNA检测的准确性。

技术研发人员：陈洪亮,郭萍,何芝,王丹,祝兴强,黄蓉,曾歆莹,郑海灵,黄志明
受保护的技术使用者：厦门万基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17