一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用

：本发明涉及基因工程和合成生物学领域，具体涉及一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用。

背景技术

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背景技术：

1、蓝藻，又被称为蓝细菌。它广泛分布于土壤表层、荒漠、海洋或温泉中，在极地等恶劣条件下也有发现。作为古老的光合作用原核生物，蓝藻中的光合色素有多种，包括：叶绿素a，藻胆蛋白和类胡萝卜素。蓝藻能够利用太阳能和co2作为主要的能源和碳源生长。同时，蓝藻简单高效的代谢途径使得蓝藻的环境适应性大大提高。蓝藻通过基因工程的手段改造后可以生产各种化学物质和生物能源，作为“微生物细胞工厂”成为研究的热点。蓝藻种类多样，分布广泛，培养方式简单。蓝藻对生长要求低，空气、水、简单的无机盐和光即可满足生长需求，降低了生产成本。此外与陆生植物相比，蓝藻光合利用率较高，生长速度快，培养周期短。遗传背景清晰，便于进行遗传操作和基因改良。因此选取蓝藻作为异源合成类胡萝卜素的底盘。

2、类胡萝卜素在自然界中的分布十分广泛，存在于所有植物能进行光合作用的组织中、藻类、光合细菌及许多非光合作用的细菌、真菌和古生菌中。动物自身不能够合成类胡萝卜素，主要是通过食物链摄取食物中的类胡萝卜素再对其结构进行加工修饰，转换成自己的类胡萝卜素。人体自身的类胡萝卜素是从食物中获取转化的，和动物一样，不能通过自身生物合成；类胡萝卜素很难利用化学方法合成，在生物体内主要是通过生物合成方式的。在植物和一些光合作用生物体中，类胡萝卜素行使着许多重要的功能，包括捕获光能、光破坏防御及保护抵制光氧化损害等。对于人类来说，这类化合物有益于人体健康，是日常饮食中必需的植物营养素。几乎所有的光合生物都能够合成常见的类胡萝卜素(番茄红素和β-胡萝卜素)，而在高等植物中则出现了更多类型的类胡萝卜素，包括叶黄素及其氧化衍生物等。但是一些特殊的类胡萝卜素仅存在于特定的物种中，例如雨生红球藻中的虾青素以及莴苣中的莴苣黄素。如果能够通过获得一种高效的类胡萝卜素合成底盘，通过基因工程和合成生物学的策略，实现对类胡萝卜素进行大量合成的目标，将具有较大的创新性和应用潜力。因此我们提出了一种利用能够异源合成类胡萝卜素的蓝细菌作为合成生物学底盘，用来解决上述问题。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、为解决现有类胡萝卜素异源合成改造过程繁琐且耗时的问题，本发明提供了一种异源合成类胡萝卜素的通用性底盘及其构建方法和应用，采用的技术方案如下：

2、本发明的目的在于提供一种异源合成类胡萝卜素的通用性底盘，该底盘以集胞藻为出发菌株，在集胞藻基因组中选择编码胡萝卜素酮化酶crto基因的中端作为插入位点，破坏该基因的正常表达，以积累大量的β-胡萝卜素。以β-胡萝卜素为前体物质进行后续的更多的类胡萝卜素的合成与生产。

3、本发明所述胡萝卜素酮化酶crto基因的genbank登录号为baa10541。

4、优选地，以蓝细菌集胞藻synechocystis sp.pcc6803为出发菌株。

5、本发明还提供了利用上述的通用性底盘生产类胡萝卜素的方法。所述方法包括如下步骤：

6、s1：克隆筛选标记元件：从pgbk-t7载体中克隆了由ampr启动子驱动的卡那霉素抗性基因kanr，以此元件(pampr：：kanr)作为后续的筛选标记。

7、s2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻synechocystis sp.pcc6803中的rubisco大亚基基因(rbcl)的启动子序列，该启动子用于驱动关键酶表达。

8、s3：酶基因的克隆：来自不同生物的用于异源合成类胡萝卜素相关酶基因x克隆于rbcl启动子的下游(rbcl：：x)，由该启动子驱动。

9、s4：表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pampr：：kanr筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcl：：x元件。

10、s5：质粒构建：在构建好的表达盒的两端，通过pcr技术扩增引入集胞藻基因组插入位点两侧的同源臂序列，并将扩增片段克隆到载体中；在集胞藻基因组中选择编码胡萝卜素酮化酶crto基因的中端作为插入位点，破坏该基因的正常表达。

11、s6：蓝细菌菌株培养：选取合适的蓝细菌菌株，并对蓝细菌菌株进行培养。

12、s7：蓝细菌的转化：s5克隆的质粒通过自然转化的方法转化蓝细菌；经转化的蓝细菌在含有50μg ml-1卡那霉素的bg-11培养基平板上筛选，其他培养筛选条件同s6。

13、s8：色素鉴定：当s7液体培养基中蓝细菌生长至od700＝2.0时，取5ml菌液离心收集细胞，以甲醇抽提积累的类胡萝卜素，利用高效液相色谱法对色素进行分离。

14、本发明中蓝细菌的培养条件为bg-11培养基，28-30℃，30-35μmol photon m-2s-1。

15、本发明中蓝细菌的转化方法为自然转化法。

16、本发明中蓝细菌转化子的筛选条件为转化的蓝细菌在含有20μg ml-1卡那霉素的bg-11培养基平板上筛选，挑选筛选得到的转基因菌株，在含有50μg ml-1卡那霉素的bg-11液体培养基中培养生长；生长条件为bg-11培养基，28-30℃，30-35μmol photon m-2s-1。

17、本发明的有益效果：

18、以活体蓝细菌为合成底盘，并充分利用蓝细菌自身可以合成较为简单的类胡萝卜素成分作为后续合成底物的这一优势，更加方便的进行异源类胡萝卜素的合成。此外，本方法利用在蓝细菌里进行基因表达的简单操作，降低了生产成本。与陆生植物相比，蓝藻光合利用率较高，生长速度快，培养周期短，遗传背景清晰，便于进行遗传操作和基因改良。作为异源合成和生产类胡萝卜素的底盘具有明显的优势，较大的应用潜力和广泛的应用范围。

技术特征：

1.本发明公开了一种基因工程菌，作为异源合成类胡萝卜素的合成生物学底盘。其特征在于，所述基因工程菌是在蓝细基因组中选择编码胡萝卜素酮化酶crto基因的中端作为插入位点，破坏该基因的正常表达。

2.本发明公开了一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用，主要包括对类胡萝卜素合成酶的选择，合成下游途径的组装与表达，集胞藻宿主合成前体积累的强化，最终实现在蓝细菌体内高效合成类胡萝卜素。

3.类胡萝卜素合成酶的选择：选取拟南芥的玉米黄质环氧化酶(zeaxanthinepoxidase，atzep)；拟南芥的番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase，atlut2)；雨生血球菌的β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolases，hpbkt)，用于异源合成类胡萝卜素。

4.本发明公开了一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求2所述的一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用，其特征在于，所述s5中，选择的集胞藻基因组插入位点为编码胡萝卜素酮解酶crto基因的中端，破坏该基因的正常表达有助于进一步简化集胞藻中的胡萝卜素代谢以及促进β-胡萝卜素的积累。在集胞藻体内大量的积累合成类胡萝卜素所需前体，更利于异源合成类胡萝卜素。

6.根据权利要求2所述的一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用，其特征在于，所述s6中，生长条件为bg-11培养基，28-30℃，30-35μmol photon m-2s-1。

7.根据权利要求2所述的一种类胡萝卜素异源合成与生产的底盘构建与应用，其特征在于，所述s7中，经转化的蓝细菌在含有20μg ml-1卡那霉素的bg-11培养基平板上筛选，挑选筛选得到的转基因菌株，在含有50μg ml-1卡那霉素的bg-11液体培养基中培养生长。

8.本发明以蓝细菌集胞藻synechocystis sp.pcc6803为出发菌株。

技术总结
本发明公开了一种用于类胡萝卜素异源合成与生产的合成生物学底盘。本发明涉及基因工程领域，提供了一种依赖蓝细菌的异源合成类胡萝卜素的方法。本发明利用了遗传背景清晰，便于进行遗传操作的蓝细菌作为异源合成类胡萝卜素的合成生物学底盘，具体地操作方法如下，主要包括对类胡萝卜素合成酶的选择，合成下游途径的组装与表达，集胞藻宿主合成前体积累的强化，最终实现在蓝细菌体内高效合成类胡萝卜素。

技术研发人员：卢山,梁瀚予,吕德新,韩东
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11