一种成纤维细胞膜片的制备方法与流程

本发明涉及细胞培养，具体涉及一种成纤维细胞膜片的制备方法。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官。难愈性创面过去主要继发于创伤、烧伤等外伤，现在压疮、糖尿病足以及血管源性疾病造成的慢性创面也在迅速增加。大面积的烧伤、软组织创伤和皮肤坏死性疾病会造成真皮缺损，严重影响患者的生存质量。

2、真皮内存在大量的真皮成纤维细胞和脐静脉内皮细胞，成纤维细胞可以合成和分泌大量的胶原纤维、蛋白和修复因子，对皮肤具有强大的更新能力。

3、传统的皮肤修复方式主要包括清创治疗、伤口涂抹敷料、植皮手术、负压治疗等，随着技术的发展，再生医学和细胞治疗为治疗难愈性创面提供了一种新的可能。

4、胰酶水解细胞的方法往往会破坏细胞外基质以及细胞表面蛋白，影响细胞的存活、粘附、增殖和分化，产生注射后细胞分布不均匀、修复效率低等问题。为解决以上问题，细胞膜片技术得到广泛关注，这种技术通过在体外连续高密度培养的细胞与细胞外基质的混合体，无需使用胰酶消化，保留了细胞外基质及细胞表面蛋白。并且细胞膜片具有一定的韧性，提高了细胞的可塑性以及保留率。与注射游离细胞相比，细胞膜片移植存活时间明显延长。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：提供一种成纤维细胞膜片(hf-cs)，并对获得的细胞膜片进行鉴定及功能检测的成纤维细胞膜片的制备方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

3、一种成纤维细胞膜片的制备方法，包括

4、步骤一、成纤维细胞的培养

5、获取部分皮肤组织，用生理盐水冲洗；

6、在超净工作台内将皮肤的表皮和皮下组织剥离，剥离过程中向组织滴加生理盐水保持湿润；

7、将真皮组织剪成块状，使用生理盐水冲洗后放入培养皿中，并加入培养基以浸没组织块后放入培养箱中培养；

8、步骤二、成纤维细胞传代培养

9、待细胞融合度达到90％时，弃去上层培养基，用0.25％胰酶在培养箱中消化2-8min；在倒置显微镜下观察到细胞形态变圆、细胞间隙增大后加入等量培养基终止消化；

10、进行离心处理；

11、弃去上清液，加入培养基重悬细胞沉淀，按预定比例接种于新的培养皿中进行传代；

12、步骤三、成纤维细胞膜片的制备

13、向基础培养基中加入50-150μg/ml的抗坏血酸，配制细胞膜片诱导培养基；

14、取3-6代的成纤维细胞，待细胞融合度80％-90％时用0.25％胰酶消化并进行离心处理；

15、用基础培养基重悬细胞沉淀，按照5×105个/孔的密度接种至多孔板中；

16、间隔2-4天逐步更换成细胞膜片诱导培养基；

17、待细胞培养到至见添加细胞膜片诱导培养基的多孔板底层细胞已形成细胞膜片，边缘变白翘起，用镊子可将整张细胞膜片与培养皿底部分离获得成纤维细胞膜片。

18、优选地，还包括

19、步骤四、成纤维细胞膜片的鉴定

20、细胞膜片成熟后，弃培养液，通过pbs冲洗3次；

21、使用4％多聚甲醛固定；

22、使用常规石蜡包埋，进行组织学切片；

23、再通过he染色后通过光学显微镜观察细胞膜片结构。

24、优选地，还包括

25、步骤五、成纤维细胞膜片的功能检测

26、成纤维细胞膜片培养基的配制：将长满多孔板的成纤维细胞成膜诱导7天后更换无血清培养基，48小时后收集上清过滤，使用时加入5％胎牛血清，制成成纤维细胞膜片条件培养基；

27、成管功能检测：将p2-p5代内皮细胞消化后，采用成纤维细胞膜片培养基重悬细胞接种到提前用基质胶包被的96孔板中，4小时采集图像；

28、细胞增殖检测：将p2-p5代内皮细胞消化后，采用成纤维细胞膜片条件培养基制备的成纤维细胞膜片条件培养基重悬细胞，均匀接种到96孔板，每孔1×103个；细胞贴壁后加入cck-8检测试剂，孵育3小时后测450nm处的吸光度，连测60h；

29、划痕实验：在6孔板中，每孔接种5×105的huvecs直至细胞长满后，用无菌200μl移液器吸头制作均匀的线性划痕；划痕后使用pbs清洗3遍，清洗划去的细胞后分别加入等体积内皮细胞培养基、hf条件培养基、hf-cs条件培养基，分别在0h、12h、24h、36h、48h采集图像，image j软件定量迁移距离，计算划痕迁移率。

30、hf为成纤维细胞，hf-cs为成纤维细胞膜片。

31、优选地，所述步骤二的成纤维细胞传代培养还可以为：

32、将细胞与培养容器分离并将细胞均匀分散于培养基中，接种于培养容器中，向培养容器中加入适量培养基，根据细胞生长状态每1-5天更换适量新鲜的培养基，待细胞长至70-100％汇合时，重复传代操作；

33、细胞每次进行传代操作，代数增加1，脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。

34、优选地，所述细胞与培养容器分离的方式包括胰酶及类似物质消化、使用细胞刮。

35、优选地，所述分散的方式包括搅拌、涡旋。

36、优选地，在培养获得脐带间充质干细胞之后，通过mtt法、wst法、dna含量检测法或atp检测法测定细胞生长曲线评估成纤维细胞的生长活性；

37、通过流式细胞术检测细胞表面标志物、三向分化测定以及pcr法检测细胞表达基因来鉴定所分离培养的成纤维细胞。

38、优选地，所述成纤维细胞膜片包含1-100层细胞；

39、所述脐带间充质干细胞膜片包含1-100层成纤维细胞层。

40、优选地，所述预定比例为1：3。

41、优选地，所述培养箱工作温度为37℃。

42、本发明的有益效果在于：通过利用细胞膜片技术对原代成纤维细胞进行成膜诱导，在一定程度上减少了因注射损失的细胞，提高了细胞的利用率和在伤口处的存活率，而且细胞膜片可促进细胞增殖、血管修复；在皮肤伤口愈合的过程中，成纤维细胞主要负责细胞外基质分子的产生和招募，和多次传代的成纤维细胞相比，从组织中培养获得的成纤维细胞更为年轻，具有更强的增殖能力；cck-8、划痕实验和血管形成实验的结果已经表明单层的成纤维细胞和制成细胞膜片的成纤维细胞都可以促进内皮细胞的增殖、迁移，形成更多的血管结构；和单层成纤维细胞相比，成纤维细胞细胞膜片在内皮细胞的增殖、迁移和血管形成的过程中展现出更为显著的促进效果；细胞实验已经证明了成纤维细胞膜片体外修复效果。

技术特征：

1.一种成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括

2.根据权利要求1所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，还包括

3.根据权利要求1所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，还包括

4.根据权利要求1所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述步骤二的成纤维细胞传代培养还可以为：

5.根据权利要求4所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所所述细胞与培养容器分离的方式包括胰酶及类似物质消化、使用细胞刮。

6.根据权利要求4所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述分散的方式包括搅拌、涡旋。

7.根据权利要求4所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，在培养获得脐带间充质干细胞之后，通过mtt法、wst法、dna含量检测法或atp检测法测定细胞生长曲线评估成纤维细胞的生长活性；

8.根据权利要求4所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞膜片包含1-100层细胞；

9.根据权利要求1所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述预定比例为1：3。

10.根据权利要求1所述的成纤维细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述培养箱工作温度为37℃。

技术总结
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种成纤维细胞膜片的制备方法，通过利用细胞膜片技术对原代成纤维细胞进行成膜诱导，在一定程度上减少了因注射损失的细胞，提高了细胞的利用率和在伤口处的存活率，而且细胞膜片可促进细胞增殖、血管修复；在皮肤伤口愈合的过程中，成纤维细胞主要负责细胞外基质分子的产生和招募，和多次传代的成纤维细胞相比，从组织中培养获得的成纤维细胞更为年轻，具有更强的增殖能力；单层的成纤维细胞和制成细胞膜片的成纤维细胞都可以促进内皮细胞的增殖、迁移，形成更多的血管结构；成纤维细胞细胞膜片在内皮细胞的增殖、迁移和血管形成的过程中展现出更为显著的促进效果；证明成纤维细胞膜片体外修复效果。

技术研发人员：赵祥婧,仝彩玲,宋鹏博
受保护的技术使用者：生物角（厦门）科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11