可冻干LAMP扩增反应试剂及其制备方法与流程

本发明涉及生物实验试剂领域，具体涉及一种可冻干lamp扩增反应试剂及其制备方法。

背景技术：

1、环介导等温扩增(lamp)技术是一种快速进行基因检测的方法。与常规pcr基因检测相比，lamp技术只需要恒温加热装置不需要进行温度循环，因此反应速度快对仪器设备依赖性小，只需要配合相应的反应指示剂使用即可在临床诊断、家庭环境、野外环境等应用场景中实现便携快速的基因检测。lamp检测技术的反应指示剂一般是颜色反应指示剂，包括基于反应体系ph变化原理的指示剂如酚红，基于反应产生荧光物质原理的指示剂sybr、基与反应体系浑浊度变化原理的焦磷酸镁沉淀，其优点是可以通过肉眼或光谱采集设备直接观察颜色变化，操作简单能够同时观察反应过程和反应终点。也有部分采用电化学指示剂如亚甲基蓝，电化学检测通过反应产物的电位变化检测反应终点，生产技术难成本，目前没有大规模普及。

2、ph指示剂显色是lamp试剂的常用检测方案，主要优点是操作简单成本极低，市面上绝大多数产品采用次方案。然而ph指示剂显色易受环境影响，如酚红容易被空气中的二氧化碳气体酸化，导致反应结果不准确。此外，目前市场中lamp反应试剂一般为液体需要冷链保存运输，液体试剂在储存和使用上都有较强的局限性。部分冷冻干燥lamp反应产品，因为冷冻干燥过程中的ph变化无法兼容ph指示剂显色功能，需要用dna凝胶电泳等方式对反应产物进行二次鉴定，也不适合居家及野外场景使用。

技术实现思路

1、本发明提供了一种可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：

2、1)加入各组分：kcl、mgcl2、tris-hcl、triton x-100或者吐温20，然后加入去离子水，调节ph，获得混合液；

3、2)加入各组分：步骤1)中获得的混合液、酚红、海藻糖、甘露醇、peg8000、dntp、bst3.0 dna聚合酶，获得lamp反应试剂。

4、进一步的，所述步骤1)混合液中的kcl的浓度为500～1000mm；mgcl2的浓度为40～100mm,tris-hcl的浓度为1～2mm，吐温20或triton x-100的浓度为0.5％～2％(v/v)。

5、进一步的，所述步骤1)混合液中的kcl的浓度为700mm；mgcl2的浓度为83mm，tris-hcl浓度为1mm，triton x-100的浓度为1％(v/v)。

6、进一步的，所述步骤1)中调节ph至8～8.8，优选为8.8。

7、进一步的，所述步骤1)中还包括对制备获得的混合液进行震荡混匀。本领域技术人员可以采用现有技术中的震荡混匀方式进行混匀，可以采用摇床或者超声混匀的方式；优选的方式为超声混匀。

8、进一步的，所述步骤1)中还包括对震荡后的混合液进行除菌；优选的方式为过滤除菌。

9、进一步的，所述步骤2)中各组分的终浓度，酚红浓度为100～500μm，海藻糖浓度3％～5％(w/v)，甘露醇浓度为0.3％～0.5％(w/v)，peg8000浓度为0.3％～1％(w/v)，所述步骤1)中获得的混合液浓度为10％(v/v)，bst 3.0dna聚合酶浓度为0.32～1u/μl，dntp浓度为1～5mm。

10、进一步的，所述步骤2)中各组分的终浓度，酚红浓度优选为200μm，海藻糖浓度优选为4％(w/v)，甘露醇浓度优选为0.3％(w/v)，peg8000浓度优选为1％(w/v)，所述步骤1)中获得的混合液浓度为10％(v/v)，bst 3.0dna聚合酶浓度优选为0.32u/μl，dntp浓度为2.5mm。

11、进一步的，将所述步骤2)中获得的lamp扩增反应试剂进行冷冻干燥后，真空密封保存；其中所述冷冻干燥的程序包括：预冷，温度-50～-35℃，保温30～120分钟；真空，温度-50～-35℃，保温30～120分钟，气压0～15pa；升华，温度-35～-20℃，保温300～600分钟，气压0～15pa；升温，温度-20～35℃，保温30～120分钟，气压0～15pa。

12、本发明的另一方面提供了一种用于lamp扩增反应的试剂。

13、本发明的另一方面提供了上述试剂在lamp扩增反应的应用。

14、本发明的有益效果是，本发明通过调整配方中离子成分与浓度，去掉了常见的铵离子成分，降低了铵离子在碱性条件下形成氨水恢发以及与空气中二氧化碳反应导致的溶液ph变化，同时添加了低浓度tris进一步增强了试剂稳定性；将冷冻干燥保护剂成分复配到试剂配方中，实现一步法冷冻干燥，生产工艺简单，耐受能力强。极大的拓展了lamp技术的应用范围，适用于临床诊断、野外检测、居家检测等需要快速便携式检测手段的应用场景。

15、本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

16、为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。

技术特征：

1.一种可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

5.根据权利要求1所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

7.根据权利要求1所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

8.根据权利要求1所述的可冻干lamp扩增反应试剂的制备方法，其特征在于，

9.一种试剂，其特征在于，

10.一种如权利要求9所述的试剂在lamp扩增反应的应用。

技术总结
本发明涉及生物实验试剂领域，具体涉及一种可冻干LAMP扩增反应试剂及其制备方法，本制备方法包括以下步骤：1)加入各组分：KCl、MgCl<subgt;2</subgt;、TRIS‑HCl、Triton X‑100或者吐温20，然后加入去离子水，调节pH，获得混合液；2)加入各组分：步骤1)中获得的混合液、酚红、海藻糖、甘露醇、PEG8000、DNTP、Bst 3.0DNA聚合酶。本发明通过调整配方中离子成分与浓度，去掉了常见的铵离子成分，降低了铵离子在碱性条件下形成氨水恢发以及与空气中二氧化碳反应导致的溶液pH变化，同时添加了低浓度TRIS进一步增强了试剂稳定性，将冷冻干燥保护剂成分复配到试剂配方中，实现一步法冷冻干燥，生产工艺简单，耐受能力强。

技术研发人员：关国良,陈巧玲,李琦,彭迪
受保护的技术使用者：常州先趋医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19