同时生产高滴度塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒抗原的方法与流程

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用bhk-21细胞同时生产高滴度塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒抗原的方法。

背景技术：

1、svv是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病(swine idiopathic vesiculardisease,sivd))及流行性暂时性新生仔猪损失(epidemic transient neonatal losses,etnl)急性病原微生物，该病发病率高，病程快，传播速度快，死亡率较低，但仔猪死亡率高。临床上主要表现为猪鼻镜、蹄部冠状带水泡、溃烂，跛足、嗜睡，新生仔猪腹泻及急性死亡等症状。目前关于该病的防控尚无可用的生物疫苗制品。目前，猪塞尼卡谷病的防控依赖于猪场有效管理，但养猪模式复杂多样，猪场管理较为落后，因此研制相应的生物制品防控该疫病的暴发流行十分迫切。

2、猪瘟是由猪瘟病毒(csfv)引起的、发生在猪上的一种高度急性、热性、接触性传染病。近年来猪瘟仍有发生，是危害养猪业最严重的传染病之一。疫苗的质量控制是迄今尚未解决的难题，其原因之一是猪瘟病毒(csfv)在细胞中的增殖能力较弱，不致细胞病变，并且生产过程中的干扰因素非常多。因此，生产高质量的猪瘟疫苗具有很高的技术难度，而且生产与检验原材料质量控制是生产工艺技术的关键，本培养方法用无血清培养基，避免bvdv污染的风险。一些猪场在筛选实践过程中，也感觉疫苗中抗原含量确实与抗体产生速度、免疫效果相关。猪瘟防控情况复杂，专家认为，还是要结合猪场的猪瘟带毒情况和其他免疫抑制病的带毒情况来看待，如果猪场污染严重，建议使用相对高效的(抗原含量相对较高)的疫苗。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、本发明的目的是针对上述问题，提供一种用bhk-21细胞同时生产高滴度塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒抗原的方法，为后期二联灭活疫苗的规模化生产奠定了基础。

3、(二)技术方案：

4、本发明通过以下技术方案实现：

5、本发明提供一种用bhk21细胞同时生产高滴度塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒抗原的方法。具体步骤如下：

6、所述猪塞尼卡谷病毒、猪瘟病毒抗原的具体制备过程如下：以生物反应器制备悬浮bhk-21细胞，待细胞密度3.0～5.0×106cells/ml，以moi 0.001～0.1剂量分别接种塞尼卡谷种毒和猪瘟病毒，接毒后生物反应器控制参数设定为do 30～60％、ph 7.0～7.4、搅拌转速80～100rpm/min、温度36.5～37.5℃，期间定时取样，以0.4％台盼蓝染色观察细胞病变情况，待细胞活率≤20％时，收获悬浮培养病毒液。

7、所述悬浮bhk-21细胞株为bhk-21-bp-2；所述塞尼卡谷种毒为猪塞尼卡谷病毒svv-zm-201801株；所述猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒株cvcc av1412。

8、本发明中，制备悬浮bhk-21细胞所用的悬浮培养培养基是无血清全悬浮培养基，包括bhk201培养基、bs-sfm v培养基、cd bhk-21培养基、vm12-sfm培养基、bhk-lsm培养基中的任一种或多种。

9、上述培养基均为市售可得的商品化培养基：bh201(壹生科深圳有限公司，产品代码10501)、bs-sfm v培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号bss203142)；cd bhk-21培养基(gibco公司，商品编号a16277-03)、vm12(sfm)(健顺生物，商品编号77017-198)、bhk-lsm(北京瑞麟和科技有限公司，商品编号ls-1)。

10、优选的，所述病毒的接种量为0.01-0.05moi，所述接毒方式为温育接毒，接毒条件为先静置沉淀细胞，然后分别接种塞尼卡谷种毒和猪瘟病毒，在温度为37℃，转速速率为60rpm/min，温育2h。

11、在本发明的一个优选的实施方式中，温育接毒为在细胞密度达3～5×106cells/ml，活率达95％以上时，静置细胞5～8小时，弃50％培养基，以moi＝0.05的接种量分别接种塞尼卡谷种毒和猪瘟病毒，37℃，60rpm/min，2h后，补加50％新鲜培养基。

12、进一步地，培养参数(ph值、do值、搅拌转速)为ph为7.0-7.4，如ph为7.1、7.2、7.3、7.4或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。do值为30％～60％，如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。搅拌转速为80～100r/min，如80r/min、90r/min、100r/min或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。

13、(三)有益效果

14、1)本发明可以用bhk21细胞同时生产高滴度塞尼卡谷病毒、猪瘟病毒抗原。

15、2)使用毒株为猪塞尼卡谷病毒svv-zm-201801株和猪瘟兔化弱毒株(cvccav1412)，避免使用强毒，均具有可靠的安全性和良好的免疫原性。

16、3)本发明中采用悬浮细胞培养病毒液，病毒滴度高，批间差异小，能够一次性大量收获抗原。与贴壁细胞培养相比，bhk-21-bp-2细胞能够适应无血清全悬浮培养，抗原产量高，批间差异小。毒价比单一抗原病毒含量高，且细胞出现明显病变。

17、4)无血清悬浮培养，无bvdv污染的风险，节省成本；

18、5)通过接毒剂量、接毒方式、反应器控制参数的优化大大提升产毒病毒含量和缩短抗原收获时间。

19、6)本发明制备的混合抗原制备二联活疫苗有良好的安全性和有效性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体。由于国内外市场上尚无塞尼卡疫苗相关的生物制品，该疫苗可有效的预防svv和csfv在猪群中的流行与传播，降低该病造成的经济损失，具有广阔的应用前景。

20、总之，本发明实现了同时对猪瘟病毒和塞尼卡谷病毒的规模化繁殖培养，且该工艺具有工艺简便、成本低、产毒效果稳定、滴度高等优势，为后期二联活疫苗的规模化生产奠定了基础。

技术特征：

1.一种猪塞尼卡谷病毒抗原和猪瘟病毒抗原的制备方法，包括步骤如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病毒的接种量为0.01-0.05moi，所述接毒方式为温育接毒，接毒条件为先静置沉淀细胞，然后分别接种塞尼卡谷种毒和猪瘟病毒，在温度为37℃，转速速率为60rpm/min，温育2h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述悬浮bhk-21细胞株为bhk-21-bp-2；所述塞尼卡谷种毒为塞尼卡谷病毒株svv-zm-201801，猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒株cvccav1412株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备悬浮bhk-21细胞所用的培养基是无血清全悬浮培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无血清全悬浮培养基为bhk201培养基、bs-sfm v培养基、cd bhk-21培养基、vm12-sfm培养基、bhk-lsm培养基中的任一种或多种。

6.权利要求1-5所述的方法在制备防治猪塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒二联疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述二联疫苗为二联活疫苗。

技术总结
本发明公开了同时生产高滴度塞尼卡谷病毒和猪瘟病毒抗原的方法。该方法包括步骤如下：以生物反应器制备悬浮BHK‑21细胞株，分别接种塞尼卡谷种毒和猪瘟病毒，接毒后生物反应器控制参数设定为DO30～60％、pH7.0～7.4、搅拌转速50～100rpm/min、温度36.5～37.5℃，期间定时取样，以0.4％台盼蓝染色观察细胞病变情况，待细胞活率≤20％时，收获悬浮培养病毒液。本发明实现了同时对猪瘟病毒和塞尼卡谷病毒的规模化繁殖培养，且该工艺具有工艺简便、成本低、产毒效果稳定、滴度高等优势，为后期二联活疫苗的规模化生产奠定了基础。

技术研发人员：吴珊珊,王贵华,孙瑶,赵辉,韩伟,付秀花,巴利民
受保护的技术使用者：中牧实业股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11