一种样本处理方法与流程

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及一种样本处理方法，更具体地，涉及一种快速处理样本的方法。

背景技术：

1、核酸检测具有灵敏度高、特异性高、早期诊断、提早干预等特点，已逐渐成为许多病原体或者疾病标志物的检测“金标准”，核酸检测对核酸样本的纯度和完整性有一定的要求，核酸样本的质量是影响后续结果的关键，当核酸的质量无法达到要求时，就会影响到后续检测结果的准确性和检出下限。样本的采集和运输过程、提取的方法、效率都会对核酸产生影响。且一般的核酸提取对仪器和人员的要求比较高，整个提取过程时间偏长。因此急需开发可快速灭活恶性传染性病毒，同时后续样本不需要核酸提取，减少整个流程中的步骤，同时不影响后续核酸检测，可直接进行检测的细胞保存液。

2、目前常用的样本保存方法，主要为采用hank’s溶液或磷酸盐缓冲液保存液以及胍盐灭活型保存液进行保存，其缺点在于：1、需要后续进行核酸提取步骤，耗时较长且易产生污染；2、各种保存液的保存效果质量较差，rna极易降解；3、采样后的样本需要低温保存，且保存时间较短。还有一部分灭活免提取的样本保存液，能够省略样本提取过程，所保存的样本直接用于后续扩增，但免提取样本保存液的裂解能力有限，且由于没有进行纯化，免提取样本中的抑制基质较多，从而导致此方法灵敏度相对核酸提取样本较低，容易出现假阴性。因此，开发一种免提取且灵敏度不受影响的样本前处理方案，具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种样本处理方法，包括以下步骤：

2、将待测样本与直扩样本处理液混合、超声处理，获得样本核酸溶液；

3、所述超声处理的频率为30khz～80khz，时间为30s～150s。优选地，所述超声处理的频率为40khz，时间为120s。

4、本发明中提及的“直扩样本处理液”具有样本灭活、核酸释放和保存功能；本发明中提及的“直扩”是指样本免提取的核酸释放及直接扩增技术，其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化以及不需要添加核酸保存液的情况下，进行直接的样本核酸扩增检测。

5、进一步地，所述直扩样本处理液包括：保护剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、缓冲体系、抑菌剂。

6、更进一步地，所述保护剂包括蔗糖、氯化胆碱、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油。

7、更进一步地，在所述直扩样本处理液中，蔗糖浓度为0.15％～1.5％(w/v)，氯化胆碱浓度为1～10mm，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1～10mm，甘露醇浓度为0.045％～0.45％(v/v)，甘油浓度为0.05％～0.5％(v/v)。

8、更进一步地，所述核酸酶抑制剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)，所述表面活性剂的浓度为0.01％～0.5％(v/v)，所述抑菌剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)，所述缓冲体系的浓度为80mm～120mm。

9、在本发明的定义中，术语“w/v”表示质量体积浓度，术语“v/v”表示体积分数，其中，w以g计，v以ml计。

10、所述核酸酶抑制剂可以是rnasin、焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍等中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，所述核酸抑制剂是rnasin。所述表面活性剂可以是曲拉通x-100、吐温20、十二烷基醇醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠等中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂是曲拉通x-100、吐温20、十二烷基醇醚硫酸钠。所述抑菌剂可以是proclin300、山梨酸钾等中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，所述抑菌剂是proclin300。所述缓冲体系可以是ph 8.0～8.5的tris-hcl缓冲液、磷酸盐缓冲液、te缓冲液等中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，所述缓冲体系是ph 8.0～8.5的tris-hcl缓冲液。

11、进一步地，在具有移液功能的容器中进行所述待测样本与直扩保存液混合；并直接通过所述容器将所述样本核酸溶液加入到所述扩增反应预混液中。

12、更进一步地，具有移液功能的容器可以是移液管、离心管等。更进一步地，所述移液管是囊泡式移液管。更进一步地，所述囊泡式移液管如图1所示。

13、进一步地，所述样本含有核酸。优选地，所述核酸为rna。

14、使用本发明的样本处理方法，采用直扩样本处理液和超声处理结合的方法，提高病原体核酸的裂解效率；对释放的核酸具有保护作用，可以在常温下有效防止样本的降解，为样本提供稳定的环境，延长核酸的保存时间，保证采集、运输、检测的安全性；并且能够实现免提取直接进行后续扩增，成本低、操作简单。

技术特征：

1.一种样本处理方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的样本处理方法，其特征在于，所述超声处理的频率为30khz～80khz，时间为30s～150s。

3.根据权利要求2所述的样本处理方法，其特征在于，所述超声处理的频率为40khz，时间为120s。

4.根据权利要求1所述的样本处理方法，其特征在于，所述直扩样本处理液包括：保护剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、缓冲体系、抑菌剂。

5.根据权利要求4所述的样本处理方法，其特征在于，所述保护剂包括蔗糖、氯化胆碱、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油。

6.根据权利要求5所述的样本处理方法，其特征在于，在所述样本处理液中，蔗糖浓度为0.15％～1.5％(w/v)，氯化胆碱浓度为1～10mm，聚乙烯吡咯烷酮浓度为1～10mm，甘露醇浓度为0.045％～0.45％(v/v)，甘油浓度为0.05％～0.5％(v/v)。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的样本处理方法，其特征在于，所述核酸酶抑制剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)，所述表面活性剂的浓度为0.01％～0.5％(v/v)，所述抑菌剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)，所述缓冲体系的浓度为80mm～120mm。

8.根据权利要求7所述的样本处理方法，其特征在于，所述核酸酶抑制剂选自rnasin、焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍中的至少一种；所述表面活性剂选自曲拉通x-100、吐温20、十二烷基醇醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠中的至少一种；所述缓冲体系选自tris-hcl缓冲液、磷酸盐缓冲液、te缓冲液中的至少一种；所述抑菌剂选自proclin300、山梨酸钾中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的样本处理方法，其特征在于，在具有移液功能的容器中进行所述待测样本与直扩保存液混合。

10.根据权利要求1所述的样本处理方法，其特征在于，所述样本核酸溶液含有rna。

技术总结
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及一种样本处理方法，更具体地，涉及一种快速样本处理的方法。本发明提供一种样本处理方法，包括以下步骤：将待测样本与直扩样本处理液混合、超声处理，获得样本核酸溶液。使用本发明的样本处理方法，采用直扩样本处理液和超声处理结合的方法，提高病原体核酸的裂解效率；对释放的核酸具有保护作用，以在常温下有效防止样本的降解，为样本提供稳定的环境，延长核酸的保存时间，保证采集、运输、检测的安全性；并且能够实现免提取直接进行后续扩增，成本低、操作简单。

技术研发人员：郭俊,吕育雄,纪博知,孙青芝,龙凤英,吴康,戴立忠
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4