间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途的制作方法

本发明涉及生物靶向药物领域，具体涉及间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途。

背景技术：

1、间皮素(mesothelin，msln)是一种细胞表面肿瘤分化抗原，间皮素在少数非关键器官与组织的间皮细胞中呈低表达，如胸膜、心包、腹膜、扁桃体、胸腺、精囊、输卵管、子宫和胎盘，而在卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、恶性间皮瘤、肺腺癌、三阴乳腺癌、胃癌、宫颈癌和胆管癌等多种实体瘤中呈高表达。基于间皮素在肿瘤组织的特异性分布及其差异表达，靶向间皮素的肿瘤免疫治疗策略可以降低非特异性毒性的风险，使其成为一个理想的肿瘤免疫治疗靶点。

2、人间皮素基因编码一个71kda的前体蛋白，由628个氨基酸组成，该前体蛋白在第295位的氨基酸arg处经弗林蛋白酶加工后分裂释放出两种蛋白质产物：脱落的巨核细胞增强因子(megakaryocyte potentiating factor，mpf)和锚定在细胞膜上的成熟间皮素。mpf是一个31kda的可溶性蛋白，被释放进入血清，具有刺激骨髓巨核细胞集落形成的活性作用。间皮素是通过糖基化磷脂酰肌醇(gpi)锚定在细胞膜上的膜结合蛋白，产生于前体蛋白的c末端，大小为40kda，包含一个ca125/muc16结合位点。其中，ca125/muc16是粘蛋白家族的一员，在卵巢癌和恶性间皮瘤中表达。

3、当间皮素处于过表达状态时，细胞内信号通路nf-κb、mapk和pi3k便会被激活，从而在肿瘤细胞的粘附、增殖、抗凋亡以及肿瘤化疗耐药等过程中发挥作用。间皮素在细胞内主要通过两条途径来发挥调节细胞功能的作用，一方面，间皮素可以通过与受体ca125/muc16之间的结合来激活下游信号通路；另一方面，异常过表达的间皮素可以通过自身的gpi结构域激活细胞内途径。ca125/muc16和间皮素之间的相互作用在体外介导异型细胞粘附，因此被认为是卵巢肿瘤腹膜转移的潜在机制。文献报道，ca125/muc16与间皮素的结合通过sgk3/foxo3信号通路下调dkk1(dickkopf-1，wnt信号通路抑制剂)，进而促进迁移。阻断ca125/muc16和间皮素结合能够恢复dkk1水平并防止卵巢癌转移。

4、间皮素在正常组织中表达有限，而在多种恶性肿瘤中过表达，因此是靶向治疗的理想候选。以间皮素为靶点的抗肿瘤策略在多个方向进行研发，并在临床前和临床试验中进行了评估，包括单克隆抗体、抗体-药物偶联物、免疫毒素、肿瘤疫苗、嵌合抗原受体t细胞疗法等。一项i期临床试验结果(nct02414269)将间皮素car-t细胞联合pd-1抑制剂应用于恶性胸膜间皮瘤、转移性肺癌和乳腺癌。靶向间皮素的car-t细胞在胸腔内给药耐受性良好，对表达间皮素的正常组织没有明显毒性，并展现出了治疗实体瘤的潜力。由美国国立癌症研究所研发的靶向间皮素的adc药物(bay 94-9343)由间皮素抗体anetumab ravtansine和有效载荷dm4构成，在i期临床研究中展现出耐受性良好、不良反应可控、药代动力学良好等特点，并且在晚期实体瘤患者中展现了令人鼓舞的初步临床活性。

5、长期以来，针对特定抗原或靶点，筛选制备其单克隆抗体，是最常用也是最成功的制备靶向结合蛋白的策略。然而，目前靶向间皮素的抗体药物存在分子量大、肿瘤穿透性差、免疫原性强、制备工艺复杂，生产成本高等局限性，因而，在维持高亲和力的基础上，进一步研发分子量低、肿瘤穿透性高、肿瘤靶向性好的间皮素靶向结合蛋白具有十分重要的临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途，本发明所提供的间皮素靶向结合蛋白可特异性地在分子蛋白水平、体外细胞与组织水平以及体内实验动物水平与间皮素蛋白、间皮素阳性肿瘤细胞或肿瘤组织特异性结合，为以间皮素为靶点的肿瘤靶向治疗策略提供了一个亲和力高、特异性好的肿瘤靶向递送载体。

2、为实现上述目的，本发明提供一种间皮素靶向结合蛋白，其氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4之一所示，所述的间皮素靶向结合蛋白能够特异性地结合于肿瘤分子标记物间皮素。

3、本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的间皮素靶向结合蛋白。

4、本发明还提供一种核素探针，为采用本发明提供的间皮素靶向结合蛋白制备的放射性核素标记探针。

5、本发明还提供一种荧光探针，为采用本发明提供的间皮素靶向结合蛋白与荧光染料通过共价偶联反应得到的荧光探针。

6、本发明还提供一种蛋白药物偶联物，由本发明提供的间皮素靶向结合蛋白和能与人血清白蛋白结合的白蛋白结合域构成融合蛋白，并通过半胱氨酸残基定点偶联4个mmae毒素分子，形成间皮素靶向蛋白药物偶联物；其氨基酸序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10之一所示。

7、其中，所述的白蛋白结合域为来自链球菌蛋白g的n-端区域的天然蛋白。

8、本发明还提供一种试剂盒，含有本发明提供的间皮素靶向结合蛋白的肿瘤诊断试剂盒。

9、本发明还提供上述的间皮素靶向结合蛋白在制备肿瘤靶向药物中的应用。

10、所述的肿瘤靶向药物为免疫细胞治疗药物。

11、所述的肿瘤靶向药物为肿瘤靶向细胞因子治疗药物。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明所提供的间皮素靶向结合蛋白可特异性地在分子蛋白水平、体外细胞与组织水平以及体内实验动物水平与间皮素蛋白、间皮素阳性肿瘤细胞或肿瘤组织特异性结合；利用荧光示踪剂标记该靶向结合蛋白构建间皮素特异性荧光探针，在体内外实验中可以高效靶向间皮素表达阳性的胃癌细胞；基于该靶向结合蛋白制备的间皮素靶向蛋白药物偶联物，可以有效杀伤间皮素表达阳性细胞。

14、与现有的抗人间皮素抗体相比，本发明提供的间皮素靶向结合蛋白，其特点包括分子量小，仅18kda左右，约为抗体分子的十分之一；体积小，具有较强的组织穿透性；免疫原性较低；具有更好调控的药代动力学表现；生产工艺简单、产量高及生产成本低等特点。

15、本发明的靶向结合蛋白对间皮素表达阳性的肿瘤细胞具有良好的靶向性，可与现有的抗肿瘤药物、载药系统及分子显像剂等连接或联合使用，用于肿瘤靶向治疗、肿瘤靶向药物递送以及肿瘤活体显像示踪，为肿瘤诊疗提供新思路、新方法。

技术特征：

1.间皮素靶向结合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seqid no.3、seq id no.4之一所示，所述的间皮素靶向结合蛋白能够特异性地结合于肿瘤分子标记物间皮素。

2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白。

3.核素探针，其特征在于：采用权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白制备的放射性核素标记探针。

4.荧光探针，其特征在于：采用权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白与荧光染料通过共价偶联反应得到的荧光探针。

5.蛋白药物偶联物，其特征在于：由权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白和能与人血清白蛋白结合的白蛋白结合域构成融合蛋白，并通过半胱氨酸残基定点偶联4个mmae毒素分子，形成间皮素靶向蛋白药物偶联物；其氨基酸序列如seq id no.5、seq id no.6、seqidno.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10之一所示。

6.试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白的肿瘤诊断试剂盒。

7.权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白在制备肿瘤靶向药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤靶向药物为免疫细胞治疗药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤靶向药物为肿瘤靶向细胞因子治疗药物。

技术总结
本发明公开了一种间皮素靶向结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4之一所示。本发明公开的间皮素靶向结合蛋白可以特异性地与表达间皮素的肿瘤细胞结合，本发明的间皮素靶向结合蛋白用于制备核素探针、荧光探针、肿瘤诊断试剂盒，制备肿瘤靶向治疗药物或肿瘤靶向药物递送体系载体，包括蛋白药物偶联物、多特异性融合蛋白，用于免疫细胞因子靶向治疗等，发挥对间皮素阳性肿瘤的预防、影像学及病理学诊断以及治疗作用。

技术研发人员：刘宝瑞,王颖
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11