鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的引物和方法

本申请涉及分子生物学检测，具体涉及一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的引物和方法。

背景技术：

1、鸡球虫病是一种寄生于鸡肠上皮细胞内的原虫病，其中柔嫩艾美耳球虫（eimeriatenella)、巨型艾美耳球虫（eimeria maxima）、堆型艾美耳球虫（eimeria acervulina）、毒害艾美耳球虫（eimeria necatrix）的危害最为严重。毒害艾美耳球虫主要通过球虫卵囊传播，并寄生于鸡小肠，以小肠中三分之一段为主。在临床发病特征中，感染毒害艾美耳球虫的养殖动物，特别是雏鸡，往往会出现精神沉郁，并伴有下痢，甚至血便等症状，同时生产性能显著降低，出栏量也严重受到影响，因此，该疾病对全世界的养禽业造成巨大经济损失。

2、从20世纪40年代起，毒害艾美耳球虫主要依靠抗球虫药物，如莫能菌素、马杜拉霉素和海南霉素已被开发和应用。然而，自20世纪70年代以来，抗药性毒害艾美耳球虫的出现远远快于新药的开发。与此同时，药物使用不可避免地导致禽肉中药物残留的增加，这也引起了公众健康担忧。因此，目前毒害艾美耳球虫的控制，更多地采用活疫苗免疫方法。不过，毒害艾美耳球虫的活疫苗也可定植于肠道组织，会影响临床样品的毒害艾美耳球虫分子检测结果。另外，疫苗的使用过程也存在毒力恢复的安全隐患。因此，基于毒害艾美耳球虫活疫苗的有效性和安全性考虑，建立鉴别毒害艾美耳球虫的疫苗株和野毒株的方法刻不容缓。此外，该方法的建立也有助于精准监测活疫苗免疫后鸡群的野毒感染情况，为鸡球虫的疫病防控提高参考。

技术实现思路

1、基于此，本申请实施例有必要提供一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的引物及试剂盒。

2、具体技术方案如下：

3、第一方面，本申请提供了一种鉴别毒害艾美耳球虫野毒株和疫苗株的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、第二方面，本申请提供了一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

5、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括采用pcr技术和/或高分辨率熔解曲线技术鉴别毒害艾美耳球虫野毒株和疫苗株。

6、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括pcr反应液、dna聚合酶、荧光染料、阳性质控标准品和阴性质控标准品中的一种或多种。

7、在其中一个实施例中，所述阳性质控标准品包括毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的全基因组，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸片段的重组质粒。

8、第三方面，本申请提供了一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的方法，所述方法包括如下步骤：

9、提取待测样本的基因组dna；

10、以所述dna为模板，采用所述的引物对或所述的试剂盒进行pcr扩增；

11、对所得pcr扩增产物进行分析，以及，根据所得分析结果鉴别待测样本为毒害艾美耳球虫野毒株、毒害艾美耳球虫疫苗株或者同时含有毒害艾美耳球虫野毒株和疫苗株。

12、可选地，采用琼脂糖凝胶电泳法和/或测序法分析所述pcr扩增产物。

13、在其中一个实施例中，电泳结果出现一条140bp~150bp大小的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与seq id no.3相同，判定所述待测样本属于毒害艾美耳球虫野毒株。

14、在其中一个实施例中，电泳结果出现一条170bp~180bp大小的电泳条带，和/或测序峰图为单一峰，测序所得序列与seq id no.4相同，判定所述待测样本为毒害艾美耳球虫疫苗株。

15、在其中一个实施例中，电泳结果出现一条170bp~180bp大小的电泳条带和一条140bp~150bp大小的电泳条带，和/或测序所得序列分别与seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列相同，判定所述待测样本同时含有毒害艾美耳球虫的疫苗株和野毒株。

16、在其中一个实施例中，pcr扩增的体系包括所述的引物、扩增缓冲液、dntp混合物、dna聚合酶、mg2+和荧光染料中的一种或多种。

17、在其中一个实施例中，所述引物的工作浓度为0.1μm~0.6μm。

18、在其中一个实施例中，pcr扩增的条件包括93℃~95℃ 4~5min；93℃~94℃ 30s~35s，50℃~65℃ 30s~40s，70℃~72℃ 20s~30s，30~35个循环；70℃~72℃ 8min~10min。

19、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：

20、本申请提供一种引物可实现对毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的鉴别。利用该引物及包含该引物的试剂盒对毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株鉴别检测，其操作简单，重复性高，特异性强。

技术特征：

1.一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用pcr技术和/或高分辨率熔解曲线技术鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应液、阳性质控标准品和阴性质控标准品中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括扩增缓冲液、dntp混合物、dna聚合酶、mg2+和荧光染料中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品包括毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的全基因组，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸片段的重组质粒。

7.一种鉴别毒害艾美耳球虫的野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，根据所得分析结果鉴别待测样本为毒害艾美耳球虫的野毒株或者疫苗株，包括：

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，pcr扩增的体系包括所述的引物、扩增缓冲液、dntp混合物、dna聚合酶、mg2+和荧光染料中的一种或多种；

10.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，pcr扩增的条件包括93℃~95℃ 4~5min；93℃~94℃ 30s~35s，50℃~65℃ 30s~40s，70℃~72℃ 20s~30s，30~35个循环；70℃~72℃8min~10min。

技术总结
本申请涉及鉴别毒害艾美耳球虫野毒株和疫苗株的引物和方法，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。利用所述引物对毒害艾美耳球虫野毒株和疫苗株鉴别检测，其操作简单，重复性高，特异性强。

技术研发人员：孙铭飞,蔡海明,肖文婉,陈兵,廖申权,戚南山,李娟,吕敏娜,林栩慧,胡俊菁,宋勇乐,张小慧,尹理君,陈祥杰,朱易斌,张健騑
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8