快速检测NAD(P)H和NTR的双酶响应荧光探针及其制备方法

本发明涉及一种能同时检测nad(p)h(还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和ntr(硝基还原酶)的双酶响应荧光探针，属于有机染料合成领域，具体为一种快速检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针及其制备方法。

背景技术：

1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad(p)h)，作为生物体中普遍存在的辅酶参与多种生物学过程，nad(p)h的水平变化与细胞内能量代谢以及线粒体功能状态高度相关。当炎症发生后，免疫系统对损伤、感染或其他刺激作出生理反应，随即免疫细胞激活且炎症因子释放。这些因素都会损坏线粒体功能，影响细胞能量代谢，导致nad(p)h的生成和利用障碍。同时，在细菌炎症的情况下，细菌在缺氧的环境中无法依靠氧气作为最终的电子受体来产生能量，只能利用硝基还原酶(ntr)将硝酸盐离子(no3-)还原为亚硝酸盐离子(no2-)，甚至进一步还原为氮气(n2)来产生能量，保证细胞的能量供应。因此，通过量化体内nad(p)h和ntr的水平，可以明确区分细菌性和非细菌性炎症，对指导临床精准用药，对症治疗以及评估炎症预后具有重大意义。

2、到目前为止，虽然已经开发了许多检测nad(p)h和ntr的小分子荧光探针，但能够同时检测nad(p)h和ntr的荧光探针还未曾有报道。单独检测nad(p)h或ntr的水平变化都没有办法既能监测炎症的发生又能准确区分细菌性炎症和非细菌性炎症。双响应荧光探针不仅具有高选择性、高灵敏度、响应速度快、操作简单和动态检测等优势，并且可以快速检测分析两种目标物，是生物分子传感器和成像的新兴有力工具。

3、具有半花菁结构的化合物有着十分优越的光谱性能，如高摩尔消光系数、良好的稳定性，以及相对较长的吸收和发射波长。除此之外，其独特的线粒体靶向能力以及近红外发射特性使以半花菁为骨架的荧光探针在生物医学领域展现出巨大的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针及其制备方法，以解决传统荧光染料检测不灵敏、不准确、不稳定以及难以对活细胞和活体内nad(p)h和ntr含量动态监测等问题。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种快速检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针，其分子结构式如下：

4、

5、本发明的另一个目的是提供上述一种快速检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)依次将4-甲基喹啉和4-硝基溴化苄溶于有机溶剂中，在110℃加热回流反应18小时，反应结束后，冷却至室温并蒸发除去有机溶剂得到粗产物，将粗产物加入到无水乙醚中析出，抽滤、用乙醚洗涤得到产物4-甲基-1-(4-硝基苄基)喹啉；

7、(2)将上述产物4-甲基-1-(4-硝基苄基)喹啉溶解于无水乙醇中，然后依次加入3-喹啉甲醛和哌啶，加入完成后将所得溶液在氮气保护下反应18小时，反应完成后冷却，将溶液蒸干，经过重结晶后得到产物1-(4-硝基苄基)-4-(2-(喹啉-3-基)乙烯基)喹啉；

8、(3)将上述产物1-(4-硝基苄基)-4-(2-(喹啉-3-基)乙烯基)喹啉溶解于无水二氯甲烷中，然后加入三氟甲烷磺酸甲酯，在氮气保护下室温搅拌，反应时间为8小时，反应结束后洗涤沉淀，抽滤并干燥即得到终产物1-甲基-3-(2-(1-(4-硝基苄基)喹啉-4-基)乙烯基)喹啉。

9、上述制备方法的合成路线如下：

10、

11、进一步方案，步骤(1)中4-甲基喹啉与4-硝基溴化苄的摩尔比为1:1.2。

12、进一步方案，步骤(1)中的有机溶剂为甲苯。

13、进一步方案，步骤(2)中4-甲基-1-(4-硝基苄基)喹啉与对3-喹啉甲醛的摩尔比为1:2。

14、进一步方案，步骤(2)中重结晶所用溶剂为乙醚。

15、进一步方案，步骤(3)中1-(4-硝基苄基)-4-(2-(喹啉-3-基)乙烯基)喹啉和三氟甲烷磺酸甲酯的摩尔比例为1:5。

16、利用上述荧光探针测试溶液中nad(p)h和ntr含量的方法，包括如下步骤：

17、制备荧光探针储备液；

18、配置一定浓度的nadh溶液和ntr溶液，检测nadh溶液和ntr溶液的紫外吸收光谱和荧光光谱；

19、进一步方案，所述方法包括以下步骤；

20、(1)称取所述探针，溶于dmso，混匀，配得荧光探针储备液，可置于4℃冰箱冷藏备用；

21、(2)制备一定浓度的nadh溶液和ntr溶液；

22、制备方法为：分别称取nadh和ntr，分布溶于哌嗪-1,4-二乙磺酸(pipes)缓冲液中配置一定度的nadh溶液和ntr溶液，4℃冰箱冷藏备用。

23、(3)在离心管中，分别加入探针储备液用pipes缓冲液(优选的ph＝7.4)，加入同体积一定浓度的nadh溶液或ntr溶液，充分混匀。优选的，加入2cm的石英比色皿中。优选的，反应温度为37℃，反应时间分别为15分钟和2小时。

24、(4)反应后用紫外可见分光光度计测试吸收光谱，用荧光分光光度计测试其荧光光谱激发波长600nm。

25、所述近红外荧光探针与nadh或ntr反应之后，荧光光谱仪检测中，所述荧光探针的激发波长为600nm，发射波长为667nm。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

27、(1)本发明提供的能同时检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针可以在细胞内定位线粒体，可以检测活细胞胞质内的nad(p)h和ntr，实现活细胞和活体的荧光成像，且具有高选择性、高灵敏度、快速检测nad(p)h和ntr的微小变化优点。

28、(2)本发明制备得到的能同时检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针，合成方法简单，条件温和，收率较高，具有化学性质稳定、光稳定性好和毒性小等优势，为荧光成像领域提供了良好的应用前景。

技术特征：

1.一种快速检测nad(p)h和ntr的双酶响应荧光探针，其分子结构如下：

2.如权利要求1所述的双酶响应荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中4-甲基喹啉与4-硝基溴化苄的摩尔比为1:1.2。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的有机溶剂为甲苯。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中4-甲基-1-(4-硝基苄基)喹啉与对3-喹啉甲醛的摩尔比为1:2。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中重结晶所用溶剂为乙醚。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中1-(4-硝基苄基)-4-(2-(喹啉-3-基)乙烯基)喹啉和三氟甲烷磺酸甲酯的摩尔比例为1:5。

技术总结
本发明公开了一种快速检测NAD(P)H和NTR的双酶响应荧光探针及其制备方法。制备得到的半花菁染料外观呈棕红色固体，可用于生物体内外的NAD(P)H和NTR的检测。所述探针的设计策略主要是基于NAD(P)H以及NTR与探针之间的氧化还原反应，电子排列改变导致探针的荧光强度变化。本发明制备得到的NAD(P)H和NTR双响应探针，可以通过荧光强度的变化快速检测分析物，具有水溶性好、光稳定性好、特异性强、灵敏度高、细胞毒性低、有利于细胞和生物体成像分析等优点，为荧光成像等领域提供了良好的应用前景。

技术研发人员：施秀英,贺月,丛辉,吴丽
受保护的技术使用者：南通大学附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12