一种TMEM27融合蛋白、全人源单链抗体及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种tmem27融合蛋白、全人源单链抗体及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、tmem27为跨膜蛋白。既往研究表明tmem27特异性地高表达于胰岛β细胞表面。过量表达tmem27会促进β细胞增殖，增加β细胞质量增加，而使用rnai沉默tmem27则会导致细胞复制减少。糖尿病患者胰岛中的tmem27 mrna水平显著低于健康对照组。因此，tmem27可能是糖尿病诊断、干预和治疗的潜在靶点。

2、因此，筛选出能与人tmem27结合的全人源单链抗体显得尤为重要，但是，现有产品的筛选主要有以下不足：一、普通elisa筛选步骤包括a，包被抗原于固相板上；b，bsa等封闭液封闭；c，加入待检抗体，孵育；d，洗涤后加入检测抗体，孵育；e，洗涤后加入hrp偶联的二抗，孵育；f，洗涤后加入hrp底物显色。缺点是步骤多，易引入假阳性或假阴性。二、单克隆的筛选和鉴定。目前一般是a，挑选细菌单克隆；b，在96孔板中生长后制备噬菌体；c，检测噬菌体与目标分子的结合能力；d，阳性克隆提取质粒；e，转化hb2151细菌以表达单链抗体；f，纯化单链抗体；g，普通elisa检测单链抗体与目标分子的结合能力。其缺点是步骤非常繁琐费时。

3、因此，亟需获得特异性高、且快速筛选的能与人tmem27结合的全人源单链抗体。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种tmem27融合蛋白、全人源单链抗体及其筛选方法和应用，旨在能快速筛选出能与tmem27特异性结合的单链抗体。

2、为实现上述目的，本发明提出一种tmem27融合蛋白，所述tmem27融合蛋白包括tmem27、绿光荧光蛋白和抗生素抗性基因；所述tmem27融合蛋白的序列如seq id no:1所示。

3、可选地，所述膜蛋白tmem27的核苷酸序列如seq id no:2所示；和/或，

4、所述绿光荧光蛋白的核苷酸序列如seq id no:3所示；和/或，

5、所述抗生素抗性基因的核苷酸序列如seq id no:4所示；和/或，

6、所述tmem27融合蛋白还包括第一蛋白接头，第二蛋白接头和t2a、所述第一蛋白接头的核苷酸序列如seq id no:5所示、所述第二蛋白接头的核苷酸序列如seq id no:6所示。所述t2a的核苷酸序列如seq id no:7所示。

7、本发明提出全人源单链抗体，用以与上述任意一项所述的tmem27结合，每个所述全人源单链抗体包括轻链和重链，

8、所述抗体1轻链如seq id no:8所示、所述抗体2轻链如seq id no:9所示、所述抗体3轻链如seq id no:10所示；和/或，

9、所述抗体1重链如seq id no:11所示、所述抗体2重链如seq id no:12所示、所述抗体3重链如seq id no:13所示。

10、本发明进一步提出一种全人源单链抗体的筛选方法，包括以下步骤：

11、s10、将如上所述的tmem27融合蛋白与表达载体、利用双酶切、设计引物，连接得重组质粒；

12、s20、将所述重组质粒转染到昆虫s2细胞中表达，筛选得表达tmem27融合蛋白的阳性细胞；

13、s30、将所述表达tmem27融合蛋白的阳性细胞用于单链抗体噬菌体文库，经过多次筛选得全人源单链抗体。

14、可选地，步骤s10中，表达载体包括pac5载体。

15、可选地，步骤s10中，所述引物包括正向引物和反向引物，

16、所述正向引物的序列如seq id no:14所示、所述反向引物的序列如seq id no:15所示。

17、可选地，步骤s10中，所述引物包括正向引物和反向引物，

18、所述正向引物的酶切位点包括kpni酶切位点；和/或，

19、所述反向引物的酶切位点包括noti酶切位点。

20、本发明进一步提出单链抗体在检测人tmem27蛋白中的应用，所述单链抗体如上所述的全人源tmem27单链抗体或上述全人源单链抗体的筛选方法得到的全人源单链抗体。

21、本发明进一步提出单链抗体在糖尿病干预与治疗中的应用，所述单链抗体如上所述的全人源tmem27单链抗体或上述全人源单链抗体的筛选方法得到的全人源单链抗体。

22、本发明提供的技术方案中，膜蛋白tmem27通过偶联绿光荧光蛋白用以指示膜蛋白tmem27，且通过与抗生素抗性基因的连接，是为了把一些不表达的野生型的细胞剔除，使得在后续转染细胞时候，能够大量富集、筛选出能表达tmem27的阳性细胞，同时也避免了膜蛋白表达纯化困难的难题。因此，所述tmem27融合蛋白可以更快速且简便地用于后续筛选出能与tmem27特异性结合的单链抗体。

技术特征：

1.一种tmem27融合蛋白，其特征在于，所述tmem27融合蛋白包括膜蛋白tmem27、绿光荧光蛋白和抗生素抗性基因；

2.如权利要求1所述的tmem27融合蛋白，其特征在于，

3.一种全人源单链抗体，用以与如权利要求1～2任意一项所述的tmem27结合，其特征在于，所述全人源单链抗体包括抗体1、抗体2和抗体3，每个所述全人源单链抗体包括轻链和重链：

4.一种全人源单链抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的一种全人源单链抗体的筛选方法，其特征在于，步骤s10中，表达载体包括pac5载体。

6.如权利要求4所述的一种全人源单链抗体的筛选方法，其特征在于，步骤s10中，所述引物包括正向引物和反向引物，

7.如权利要求4所述的一种全人源单链抗体的筛选方法，其特征在于，步骤s10中，所述引物包括正向引物和反向引物，

8.一种全人源单链抗体在检测人tmem27蛋白中的应用，其特征在于，所述全人源单链抗体包括如权利要求3所述的全人源单链抗体或由权利要求4～7任意一项所述的全人源单链抗体的筛选方法得到的全人源单链抗体。

9.一种全人源单链抗体在糖尿病干预与治疗中的应用，其特征在于，所述全人源单链抗体包括如权利要求3所述的全人源单链抗体或由权利要求4～7任意一项所述的全人源单链抗体的筛选方法得到的全人源单链抗体。

技术总结
本发明公开一种TMEM27融合蛋白、全人源单链抗体及其筛选方法和应用，所述TMEM27融合蛋白包括膜蛋白TMEM27、绿光荧光蛋白和抗生素抗性基因；所述TMEM27融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示，本发明提供的技术方案中，TMEM27通过偶联绿光荧光蛋白可以指示膜蛋白TMEM27的表达，且抗生素抗性基因的连接，在后续转染细胞时候，能够大量富集、筛选出能表达TMEM27的阳性细胞，避免了膜蛋白表达纯化困难的难题。

技术研发人员：郑沛林,吴传安,周海蓉
受保护的技术使用者：深圳市龙华区人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17