抗CHI3L1的纳米抗体及其应用

本发明涉及生物，具体涉及抗chi3l1的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、几丁质酶-3样蛋白-1(chi3l1)是一种分泌型糖蛋白，相对分子量约为40kda，具有由383个氨基酸组成的多肽链，肽链的三个n端氨基酸是酪氨酸(y)、赖氨酸(k)和亮氨酸(l)，因此，chi3l1也命名为ykl-40或rbp-39。美国芝加哥大学医学中心(university ofchicago medical center)的研究人员发现，chi3l1基因的变异可能会影响人类软骨糖蛋白的分泌，对于早期判定病人是否有气喘病征有其指标意义。通过系统生物学方法，结合二代测序表达谱技术和蛋白质组学技术，发现chi3l1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标记物。

2、肝硬化是各种慢性肝病的最终病理结果，而纤维化是肝硬化的前兆。肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积，它不是一个独立的疾病，是由病毒感染、毒素、液体等原因引起的损伤肝细胞的一个慢性修复过程。肝活检是检测和分期肝纤维化的重要标准。然而，这是一种侵入性手术，存在一定的局限性，因此，有必要用非侵入性的技术代替肝活检。研究表明，血清chi3l1水平在酒精性肝硬化病人中升高，血液中的chi3l1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。

3、重链抗体(heavy-chain antibody)是一种天然缺失轻链，仅由重链组成的抗体，存在于骆驼、羊驼、鲨鱼及软骨鱼类等动物中。单域重链抗体，即纳米抗体(varia bledomain of heavy chain of heavy-chain antibody，vhh)是指仅由重链抗体可变区(variable region)组成的基因工程抗体。与普通抗体相比，纳米抗体具有分子量小，水溶性好，稳定性高等优点，目前已广泛应用于食品科学研究，医学诊断，药物研发等领域。

4、由于chi3l1分子量较小，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应受到影响，从而严重影响检测效率。

5、因此，需要开发一种新的方案改善以上问题。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种抗chi3l1的纳米抗体及其应用以改善由于chi3l1分子量小，常规抗体结合后难以识别裂隙与空腔中的抗原决定簇从而影响特异性结合反应，降低检测效率的问题。

2、一方面，本发明提供一种抗chi3l1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体chi6、纳米抗体chi13，纳米抗体chi23，纳米抗体chi37；所述纳米抗体chi6的氨基酸序列如seqid no.1所示；所述纳米抗体chi13的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述纳米抗体chi23的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述纳米抗体chi37的氨基酸序列如seq id no.4所示。

3、第二方面，本发明提供编码所述纳米抗体基因的核苷酸序列，所述纳米抗体chi6、chi13、chi23、chi37如seq id no.5-seq id no.8所示。

4、所述纳米抗体chi6的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3分别选自seq id no.10，seq idno.12，seq id no.14；

5、所述纳米抗体chi13的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3分别选自seq id no.17，seqid no.19，seq id no.21；

6、所述纳米抗体chi23的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3分别选自seq id no.24，seqid no.26，seq id no.28；

7、所述纳米抗体chi37的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3分别选自seq id no.31，seqid no.33，seq id no.35。

8、第三方面，本发明提供一种抗chi3l1的纳米抗体的制备方法，包括噬菌体展示技术和基因工程重组技术。

9、可选地，所述噬菌体展示技术，包括以下步骤：所述噬菌体展示技术是将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。

10、可选地，所述基因工程重组技术，包括以下步骤：将编码所述纳米抗体的基因进行克隆，克隆完成后连接至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。

11、第四方面，本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质包括所述纳米抗体的互补决定区序列中的至少一条，且同源性不低于80％。

12、第五方面，本发明提供一种所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。

13、可选地，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析。

14、可选地，所述纳米抗体应用时可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒直接用于分析检测。

15、可选地，所述纳米抗体应用时可以经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。

16、可选地，所述纳米抗体均可单独应用于免疫学检测。

17、第六方面，本发明提供的纳米抗体的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得亲和力、特异性和稳定性更高的突变体。

18、本发明具备的有益效果包括：

19、(1)本发明提供的纳米抗体能够与抗原chi3l1特异性结合，并且亲和性与纳米抗体浓度呈依赖性；且能够识别裂隙与空腔中的抗原决定簇，提高检测效率；

20、(2)本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗原替代物的筛选和制备，具有较高的应用价值；

21、(3)本发明提供的纳米抗体可以应用于免疫学检测，包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析。

技术特征：

1.抗chi3l1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体chi6、纳米抗体chi13，纳米抗体chi23，纳米抗体chi37；所述纳米抗体chi6的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述纳米抗体chi13的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述纳米抗体chi23的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述纳米抗体chi37的氨基酸序列如seq id no.4所示。

2.编码如权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述纳米抗体chi6基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述纳米抗体chi13基因的核苷酸序列如se1 id no.6所示；所述纳米抗体chi23基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述纳米抗体chi37基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，

4.如权利要求1所述的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括噬菌体展示技术和基因工程重组技术。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述噬菌体展示技术，包括以下步骤：所述噬菌体展示技术是将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程重组技术，包括以下步骤：将编码所述纳米抗体的基因进行克隆，克隆完成后连接至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。

7.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括权利要求3中所述纳米抗体的互补决定区序列中的至少一条，且同源性不低于80％。

8.如权利要求1所述的纳米抗体的氨基酸序列在制备突变纳米抗体中的应用。

9.如权利要求1所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。

技术总结
本发明提供了抗CHI3Ll的纳米抗体及其制备方法与应用，本发明提供的纳米抗体包括纳米抗体CHI6、纳米抗体CHI13、纳米抗体CHI23以及纳米抗体CHI37，公开了纳米抗体的氨基酸序列以及编码基因序列；同时，本发明提供的制备方法具有普适性，且纳米抗体与抗原CHI3L1能够进行特异性结合，且亲和性与纳米抗体浓度呈依赖性；本发明提供的纳米抗体能够广泛应用于免疫学检测分析中。

技术研发人员：涂追,陈梦娜,何庆华,李燕萍,刘传勇,吴箫
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17