一种采用电融合法制备T淋巴杂交瘤细胞株的方法

本发明涉及淋巴杂交瘤细胞，具体公开一种采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法。

背景技术：

1、人和动物的获得性免疫系统是基于b淋巴细胞和t淋巴细胞的高度特异性抗原受体以及克隆的选择。b淋巴细胞通过分泌抗体引起体液免疫应答，t淋巴细胞则介导引起所识别细胞被破坏的细胞免疫应答。t淋巴细胞在细胞免疫应答中发挥着核心作用，在t淋巴细胞表面上表达的t细胞受体(tcr)介导特定抗原的识别和结合。b淋巴细胞与肿瘤细胞融合产生了b淋巴细胞杂交瘤，促进了单克隆抗体技术的发展。由于很少有抗体能够识别肿瘤抑制基因apc上的特异性主要组织相容性复合体(mhc)，因此必须通过t淋巴细胞生物测定来确定apc的抗原呈递水平。t淋巴细胞杂交瘤具有优于原代t淋巴细胞克隆的优点，能识别由固定的apc呈递的抗原，是一种高度特异、可靠、可重复和方便的t淋巴细胞试剂，可以大量培养并广泛用于抗原呈递研究。t淋巴细胞杂交瘤提供了对apc上特异性mhc的定量测量。

2、制备t淋巴细胞杂交瘤，能够获得无限增殖的稳定的易于标准化的抗原特异性t淋巴细胞，其对于体外的抗原呈递和识别以及下游信号传导的研究具有重要的意义。然而，目前很难一次性获得稳定、可重复性高且融合率高的t淋巴杂交瘤细胞株。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，采用电融合法制备t淋巴细胞杂交瘤，融合率大大提高，可一次性获得大量稳定的、可大规模繁殖的t淋巴杂交瘤细胞株，且可重复性高。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

3、一种采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，包括以下步骤：

4、s1，将小鼠进行胶原蛋白的抗原免疫后，取免疫小鼠的淋巴结，吹洗，得t淋巴细胞；

5、s2，将所述t淋巴细胞和t胸腺瘤细胞加入dmem培养基中，混合均匀，固液分离，得混合细胞；向所述混合细胞中加入电融合缓冲液，进行电融合，固液分离，得t淋巴细胞杂交瘤；

6、其中，所述电融合包括排队阶段和融合阶段；所述排队阶段的电压为65～85v，所述融合阶段的电压为900～1050v；

7、s3，提取正常小鼠的腹腔细胞，用hat培养液重悬，将所得饲养细胞液加入培养板中进行培养，得含饲养细胞液的培养板；

8、将所述t淋巴细胞杂交瘤用hat培养液重悬，将所得重悬液加入所述含饲养细胞液的培养板中进行培养，测定每个孔的抗体效价，得阳性孔；对所述阳性孔进行亚克隆，得可产生单克隆抗体的t淋巴杂交瘤细胞株。

9、相对于现有技术，本发明提供的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，通过控制电融合的电压，将t淋巴细胞和t胸腺瘤细胞进行了融合：在电击排队阶段，对细胞施加一个较小的直流电压，使细胞能够相互接触到；在电融合阶段，对细胞施加一个较高的电压，以达到瞬间击穿细胞膜的目的。发明人通过大量试验发现，排队电压为65～85v、融合电压为900～1050v时，t淋巴细胞和t胸腺瘤细胞的融合数量远大于其他电压范围(与其他电压范围的细胞融合数差异显著)。本发明将正常小鼠的腹腔细胞作为t淋巴细胞杂交瘤的饲养细胞，大大提升了t淋巴细胞杂交瘤在培养过程中的存活率，降低了假阳性的概率。本发明通过控制电融合的条件，提升了t淋巴细胞和t胸腺瘤细胞的融合数量；通过控制t淋巴细胞杂交瘤的培养条件，提高了t淋巴细胞杂交瘤的存活率；整体工艺成本低，可重复性好，t淋巴杂交瘤细胞株的稳定性高，显著提升了经济效益。

10、优选的，步骤s1中，所述胶原蛋白为i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白或iii型胶原蛋白。

11、示例的，步骤s1中，所述抗原免疫包括5～7次免疫注射，每次所述免疫注射间隔12～15天，每次所述免疫注射的抗原量为35～40μg/只。

12、本发明优选的抗原免疫条件，可以在提高效率和人工成本的同时，进一步提高抗原的免疫效果。

13、优选的，步骤s1中，采用不完全培养基进行所述吹洗。

14、示例的，步骤s1中，所述吹洗后还包括：用dmem培养液重悬，离心，细胞用dmem培养液清洗，离心。本发明通过上述步骤，可以进一步去除t淋巴细胞中的杂质成分。

15、优选的，步骤s2中，所述t胸腺瘤细胞为bw5147.g.1.4。

16、示例的，步骤s2中，将所述t淋巴细胞和t胸腺瘤细胞加入dmem培养基中前，需要对bw5147.g.1.4进行复苏和扩大培养。

17、优选的，步骤s2中，所述排队阶段的时间为25～50s，频率为100khz～10mhz；所述融合阶段的时间为25～50μs/次，电穿孔次数为1～3次。

18、优选的，步骤s2中，所述t淋巴细胞和所述t胸腺瘤细胞的细胞数比为1:(3.5～4.5)。

19、优选的，步骤s2中，所述t淋巴细胞的个数为(2～3)×107个。

20、示例的，步骤s2中，所述混合细胞需要用电融合缓冲液清洗2次，离心，用吸管吸净混合细胞中残留的液体后，再加入电融合缓冲液，进行电融合。

21、优选的，步骤s2中，加入所述电融合缓冲液后，细胞浓度为(0.5～1.5)×107个/ml。

22、本发明通过限定电融合的上述条件，可以进一步提升t淋巴细胞杂交瘤的融合率。

23、优选的，步骤s3中，所述腹腔细胞的提取步骤包括：

24、拉颈处死所述正常小鼠，用镊子提起腹部皮肤，剪开皮肤，向两侧拉开皮肤使腹膜充分暴露，提起腹膜，注入不完全dmem培养液，用手轻揉腹部l～2min，抽出所述不完全dmem培养液，固液分离，得所述腹腔细胞。

25、优选的，步骤s3中，所述腹腔细胞用hat培养液重悬后，细胞浓度为(1.5～2.5)×105个/ml。

26、示例的，步骤s3中，所述培养板为96孔培养板。

27、优选的，步骤s3中，所述培养板中每孔含90～110μl所述饲养细胞液。

28、优选的，步骤s3中，所述t淋巴细胞杂交瘤用hat培养液重悬后，细胞浓度为(4～6)×105个/ml。

29、优选的，步骤s3中，所述含饲养细胞液的培养板中每孔加入2滴所述重悬液。

30、优选的，步骤s3中，所述培养在温度为35～37℃、co2体积含量为4.5％～5.5％的培养箱中进行。

31、优选的，步骤s3中，所述腹腔细胞在所述培养板中的培养时间为3～5天，所述t淋巴细胞杂交瘤在所述含饲养细胞液的培养板中的培养时间为10～14天。

32、优选的，步骤s3中，所述抗体效价采用间接elisa法进行测定。

33、示例的，步骤s3中，通过有限稀释法对所述阳性孔进行亚克隆。

34、优选的，步骤s3中，所述亚克隆的次数为2～4次。

技术特征：

1.一种采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s1中，所述胶原蛋白为i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白或iii型胶原蛋白；和/或

3.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s1中，所述排队阶段的时间为25～50s，频率为100khz～10mhz；和/或

4.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s2中，所述t淋巴细胞和所述t胸腺瘤细胞的细胞数比为1:(3.5～4.5)；和/或

5.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s2中，加入所述电融合缓冲液后，细胞浓度为(0.5～1.5)×107个/ml。

6.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s3中，所述腹腔细胞用hat培养液重悬后，细胞浓度为(1.5～2.5)×105个/ml；和/或

7.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s3中，所述t淋巴细胞杂交瘤用hat培养液重悬后，细胞浓度为(4～6)×105个/ml；和/或

8.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s3中，所述培养在温度为35～37℃、co2体积含量为4.5％～5.5％的培养箱中进行。

9.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s3中，所述腹腔细胞在所述培养板中的培养时间为3～5天，所述t淋巴细胞杂交瘤在所述含饲养细胞液的培养板中的培养时间为9～12天。

10.如权利要求1或2所述的采用电融合法制备t淋巴杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，步骤s3中，所述亚克隆的次数为2～4次。

技术总结
本发明涉及淋巴杂交瘤细胞技术领域，具体公开一种采用电融合法制备T淋巴杂交瘤细胞株的方法。本发明通过控制电融合的电压，将T淋巴细胞和T胸腺瘤细胞进行了融合：在电击排队阶段，对细胞施加一个较小的直流电压，使细胞能够相互接触到；在电融合阶段，对细胞施加一个较高的电压，以达到瞬间击穿细胞膜的目的。发明人通过大量试验发现，排队电压为65～85V、融合电压为900～1050V时，T淋巴细胞和T胸腺瘤细胞的融合数量远大于其他电压范围。本发明将正常小鼠的腹腔细胞作为T淋巴细胞杂交瘤的饲养细胞，大大提升了T淋巴细胞杂交瘤在培养过程中的存活率，降低了假阳性的概率。

技术研发人员：赵在远,程华,孔泽娟,韩炜,李晨辉,殷九一,郭彤
受保护的技术使用者：河北省科学院生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12