同时检测含非洲猪瘟病毒多种猪疫病毒的引物探针和方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种同时检测非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)、猪瘟病毒(classical swinefever virus，csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，prrsv)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，pcv2)和猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)是目前国内生猪养殖和贸易过程中极具危害性的5种猪疫病病原，近年来这些病原在我国的防控形势非常严峻。

2、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病和pcv2引起的猪皮炎和肾病综合征并不总是表现出典型的临床症状，而且这几种疾病的临床症状相似，容易相混淆，在疫病的早期阶段或者当少数动物受到感染时，可能很难实现临床诊断。

3、目前，这5种病原检测的研究多集中于血清学和分子生物学检测方法。其中elisa、免疫层析等血清学检测方法成本低、操作简单快速，可满足大批量样本检测，但也存在特异性、敏感性相对较低的缺点，由此该方法在此类重大动物疫病种仅适用于大批量的样本筛选，而对于病原的精确定性仍需要结合其它检测方法。而pcr及荧光pcr技术在特异性、敏感性、稳定性和可定量分析等方面具有独特的优势，是目前当前国内外最常用和可靠的病原检测方法。

4、多重pcr在单重pcr的基础上进行改进和发展，即在同一个反应体系中加入两对以上引物，可实现对多种病原的快速精准同时检测。与单重pcr相比，多重pcr拥有单重pcr的灵敏性和特异性，又较之快捷和经济，也降低了试剂耗材及时间成本。

5、目前已有相关学者建立了非洲猪瘟及其1-3种病毒性类症的多重pcr检测方法，但尚未见针对非洲猪瘟病毒和上述4种类症病毒(csfv、prrsv、pcv2和prv)的多重pcr检测方法。多重pcr方法的建立，不但要考虑引物的特异性等方面，还要特别考虑同一体系内各引物之间的相互干扰。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种同时检测非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用。

2、本发明的目的之一在于：提供一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物探针组，其特征在于，用于多重荧光pcr检测，其中：检测非洲猪瘟病毒的引物对如seq id no.1-2所示；检测非洲猪瘟病毒的探针如seq id no.3所示；检测猪瘟病毒的引物对如seq id no.4-5所示；检测猪瘟病毒的探针如seq id no.6所示；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对如seq id no.7-8所示；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针如seq id no.9所示；检测猪伪狂犬病毒的引物对如seqid no.10-11所示；检测猪伪狂犬病毒的探针如seq id no.12所示；检测猪圆环病病毒2型的引物对如seq id no.13-14所示；检测猪圆环病病毒2型的探针如seq id no.15所示。

3、优选地，检测非洲猪瘟病毒的引物对的pcr产物片段大小为242bp；检测猪瘟病毒的引物对的pcr产物片段大小为245bp；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对的pcr产物片段大小为340bp；检测猪伪狂犬病毒的引物对的pcr产物片段大小为379bp；检测猪圆环病病毒2型的引物对的pcr产物片段大小为569bp。

4、本发明的目的之二在于：提供上述引物探针组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。

5、本发明的目的之三在于：提供一种包含上述引物探针组的试剂盒。

6、进一步地，所述试剂盒还包括asfv、csfv、prrsv、prv和pcv2的标准质粒，其中构建asfv的标准质粒引物对如seq id no.16、seq id no.17所示；构建csfv的标准质粒引物对如seq id no.18、seq id no.19所示；构建prrsv的标准质粒引物对如seq id no.20、seqid no.21所示；构建prv的标准质粒引物对如seq id no.22、seq id no.23所示序列；构建pcv2的标准质粒引物对如seq id no.24、seq id no.25所示序列。

7、本发明的目的之四在于：提供上述试剂盒的多重荧光pcr反应体系如下：premixex taqtm(probe qpcr)(2×)25μl，如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的引物对、检测猪瘟病毒的引物对、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对、检测猪伪狂犬病毒的引物对、检测猪圆环病病毒2型的引物对各3.2μl，如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的探针、检测猪瘟病毒的探针、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针、检测猪伪狂犬病毒的探针、检测猪圆环病病毒2型的探针各0.6μl，dna模板2.5μl，ddh2o 3.5μl。

8、优选地，多重荧光pcr反应程序如下：95℃30sec，95℃5sec，56℃34sec，循环45次，耗时56min。

9、优选地，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为5.38×101copies/μl，猪瘟病毒的最低检测下限为3.65×101copies/μl，猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为7.06×101copies/μl，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为5.03×101copies/μl，猪圆环病毒2型的最低检测下限为5.44×101copies/μl。

10、本发明的目的之四在于：提供上述试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。

11、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

12、本发明提供了专用引物以及相应的最佳反应条件，其对asfv、csfv、prrsv、prv以及pcv2的质粒标准品的最低检出限分别为5.38×101copies/μl、3.65×101copies/μl、7.06×101copies/μl、5.03×101copies/μl、5.44×101copies/μl，灵敏性高。

13、该方法仅特异扩增asfv、csfv、prrsv、prv和pcv2，与pedv、tgev、ppv无交叉反应，特异性强；组内、组间变异系数小于2％，具有良好的重复性。

14、本发明建立的多重荧光定量pcr检测方法为asfv、csfv、prrsv、prv以及pcv2的临床检测及流行病学调查提供了一种快速、敏感、特异的技术手段。

技术特征：

1.一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物探针组，其特征在于，用于多重荧光pcr检测，其中：

2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，检测非洲猪瘟病毒的引物对的pcr产物片段大小为242bp；检测猪瘟病毒的引物对的pcr产物片段大小为245bp；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对的pcr产物片段大小为340bp；检测猪伪狂犬病毒的引物对的pcr产物片段大小为379bp；检测猪圆环病病毒2型的引物对的pcr产物片段大小为569bp。

3.如权利要求1或2所述引物探针组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。

4.一种包含如权利要求1或2所述引物探针组的试剂盒。

5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，多重荧光pcr反应体系包括：

6.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，多重荧光pcr反应程序如下：95℃30sec，95℃5sec，56℃34sec，循环45次，耗时56min。

7.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为5.38×101copies/μl，猪瘟病毒的最低检测下限为3.65×101copies/μl，猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为7.06×101copies/μl，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为5.03×101copies/μl，猪圆环病毒2型的最低检测下限为5.44×101copies/μl。

8.如权利要求4-7任一项所述试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用，该引物探针组包括检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物对和探针。本发明能够同时对非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒进行快速检测，且具有良好的特异性、敏感性和重复性，对非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的质粒标准品最低检出限仅为10<supgt;1</supgt;数量级，为非洲猪瘟及其难以临床区别的病毒性类症的鉴别诊断提供高效、快速和准确的技术手段。

技术研发人员：潘孝成,徐爽爽,王洁茹,殷冬冬,沈学怀,尹磊,赵瑞宏,戴银,胡晓苗,周学利,候宏艳
受保护的技术使用者：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19