一种多基因表达载体、D-氨基酸及其制备方法与流程

本申请涉及生物，尤其涉及一种多基因表达载体、d-氨基酸及其制备方法。

背景技术：

1、d-氨基酸是一种非天然的手性化合物，在食品、医药和化妆品化工领域有着重要的作用。在通常的情况下，由于在肝、肾以及血液中很少有代谢通路能够代谢d-氨基酸，因此d型对映异构体不仅比l型构型的药物更加有效，而且在对抗酶降解方面更加的稳定。因此对d-氨基酸的合成方法进行研究具有重大的意义。

2、而现有d-氨基酸制备工艺主要是化学合成法和生物合成法，其中，化学法合成d-氨基酸主要通过拆分d，l-氨基酸的外消旋体和从潜手性底物出发通过不对称催化而实现化学合成，但是其缺点在于合成的过程中会产生大量废弃物污染环境，不符合绿色制造的理念，同时在反应过程中需要特殊的温度和压力环境，使得生产成本高，并且部分方法获得的产物光学纯度较低，需要进一步进行拆分提纯；而目前的生物合成方法通过特定的生物载体表达出d-氨基酸，或者通过中间生物表达载体表达出催化l-氨基酸转变为d-氨基酸的催化酶，但是由于生物载体直接表达出d-氨基酸的效率低，因此难以得到大量d-氨基酸，而通过中间生物表达载体表达出催化酶的过程中会出现大量不稳定的中间产物，这些不稳定的中间产物会与d-氨基酸混合而难以分离出纯净的d-氨基酸。

技术实现思路

1、本申请提供了一种多基因表达载体、d-氨基酸及其制备方法，以解决现有技术中d-氨基酸制备工艺所存在的污染环境、生产成本高、产物纯度低和中间产物难以分离的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种多基因表达载体，所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达l-氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列。

3、可选的，所述第一目的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；和/或，

4、所述第二目的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；和/或，

5、所述第三目的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的多基因表达载体的方法，所述方法包括：

7、以表达l-氨基酸脱氨酶目的基因的质粒为模板，采用第一引物组进行pcr扩增，得到第一目的基因；

8、对表达载体和所述第一目的基因分别进行第一酶切，后进行dna连接酶连接，得到仅含第一目的基因的第一表达载体；

9、以表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第二引物组进行pcr扩增，得到第二目的基因；

10、对所述第一表达载体和所述第二目的基因分别进行第二酶切，后进行dna连接酶连接，得到含第一目的基因和第二目的基因的第二表达载体；

11、以表达甲酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第三引物组进行pcr扩增，得到第三目的基因；

12、对所述第二表达载体和所述第三目的基因分别进行第三酶切，后进行dna连接酶连接，得到含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。

13、可选的，所述第一引物组包括pmlaad-bamhi-f和pmlaad-hindiii-r，所述pmlaad-bamhi-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pmlaad-hindiii-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。

14、可选的，所述第二引物组包括stdapdh-ndei-f和stdapdh-kpni-r，所述stdapdh-ndei-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述stdapdh-ndei-r的核苷酸序列如seq idno.7所示。

15、可选的，所述第三引物组包括fdh-kpni-f和fdh-xhoi-r，所述fdh-kpni-f的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述fdh-xhoi-r的核苷酸序列如seq id no.9所示。

16、可选的，所述第一酶切的酶切位点为bamhi和hindiii；和/或，

17、所述第二酶切的酶切位点为ndei和kpni；和/或，

18、所述第三酶切的酶切位点为kpni和xhoi

19、第三方面，本申请提供了一种催化酶组合物，所述催化酶组合物由第一方面所述的多基因表达载体表达出。

20、第四方面，本申请提供了一种d-氨基酸，所述d-氨基酸是由l-氨基酸为底物，并以第三方面所述的催化酶组合物催化反应得到的。

21、第五方面，本申请提供了一种制备第四方面所述的d-氨基酸的方法，所述方法包括：

22、于缓冲液体系中分别加入l-氨基酸、nadp、甲酸钠和第三方面所述的催化酶组合物，并进行催化反应，得到催化产物；

23、对所述催化产物进行酸碱度调节至预设酸碱度，并进行离心过滤和纯化，得到初级目标产物；

24、对所述初级目标产物进行旋转蒸发，后进行结晶，得到d-氨基酸产品。

25、可选的，所述催化反应的温度为25℃～37℃，所述催化反应的时间为8h～32h；和/或，

26、所述预设酸碱度为1～2。

27、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

28、本申请实施例提供的一种多基因表达载体，通过在多基因表达载体中引入可表达l-氨基酸脱氨酶的第一目的基因、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的第二目的基因和甲酸脱氢酶的第三目的基因，通过该多基因表达载体可以表达出含有l-氨基酸脱氨酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化酶组合物，而该催化酶组合物可以利用“一锅煮”的方法以l型氨基酸出发合成出高附加价值的d型氨基酸，不仅避免了中间产物的分离，还可以使得中间产物在生成之前就被消耗，解决了不稳定的中间产物难以分离的问题，同时由于采用了中间表达载体表达催化酶组合物的形式，具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点，使得其在工业生产中具有很好的应用前景。

技术特征：

1.一种多基因表达载体，其特征在于，所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达l-氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列。

2.根据权利要求1所述的多基因表达载体，其特征在于，所述第一目的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；和/或，

3.一种制备如权利要求1或2所述的多基因表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一引物组包括pm laad-bamhi-f和pm laad-hindiii-r，所述pm laad-bamhi-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pmlaad-hindiii-r的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二引物组包括stdapdh-ndei-f和stdapdh-kpni-r，所述stdapdh-ndei-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述stdapdh-ndei-r的核苷酸序列如seq id no.7所示。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三引物组包括fdh-kpni-f和fdh-xhoi-r，所述fdh-kpni-f的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述fdh-xhoi-r的核苷酸序列如seq id no.9所示。

7.一种催化酶组合物，其特征在于，所述催化酶组合物由权利要求1或2所述的多基因表达载体表达出。

8.一种d-氨基酸，其特征在于，所述d-氨基酸是由l-氨基酸为底物，并以权利要求7所述的催化酶组合物催化反应得到的。

9.一种制备如权利要求8所述的d-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化反应的温度为25℃～37℃，所述催化反应的时间为8h～32h；和/或，

技术总结
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种多基因表达载体、D‑氨基酸及其制备方法；所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达L‑氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列；通过该多基因表达载体可以表达出含有L‑氨基酸脱氨酶、内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化酶组合物，解决了不稳定的中间产物难以分离的问题，且具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点，使得其在工业生产中具有很好的应用前景。

技术研发人员：李倩,唐德强,肖建,李思杰,阮期平
受保护的技术使用者：绵阳晟氏健康科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12