一种低频突变BRAF基因的检测方法与流程

本发明属于braf基因测序，尤其涉及一种低频突变braf基因的检测方法。

背景技术：

1、有害的序列变异在很多不同类型癌症的发生和发展过程中起着重要作用。作为金标准的sanger测序技术，对生殖系统变异检测的方法已经十分成熟，然而对于体细胞突变的检测，尤其是对一致性的肿瘤样本中低频变异的检测极具挑战性。

2、使用经典sanger法测序时，难以检测出低于25％的低频突变。而应用appliedbiosystemstmminor variant finder软件，可通过毛细管测序仪，通过最大程度扣除背景噪音信号，可通过对照样本中区分出背景噪声，目视检测出突变峰值，从检测出低至5％的低频突变。

3、braf基因编码b-raf蛋白，参与细胞信号调节，生长和生存，它的突变是多个实体瘤的重要治疗靶点之一，其在黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌和nsclc中的突变率不一。brafv600d/e/k/r突变(i类突变)导致强烈激活braf激酶活性，组成性活化mapk通路，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，且对braf和mek抑制剂敏感。针对不同瘤种的braf突变患者，目前分别获批了不同的靶向治疗药物。

4、为了检测braf基因突变，可以采用sanger法测序，且结合appliedbiosystemstmminor variant finder软件分析，虽然能够检测出braf基因突变中的低至5％的低频突变，但是对于低于5％的低频突变则无法得出准确地检测结果。

5、总之，当前的测序方法中，针对于braf基因突变，采用经典sanger测序法难以检测低于25％的低频突变，结合applied biosystemstmminor variant finder虽然能够检出低至5％的突变，但对于更低的突变则仍无法准确检出。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种低频突变braf基因的检测方法，包括：

2、通过针对于目标样本片段的braf基因扩增过程中，加入与所述目标样本片段中的野生模板匹配的阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，测序得到与所述目标样本片段对应的测序结果。

3、优选地，所述阻断引物的核酸序列如seq id no.1所示。

4、优选地，所述通过针对于目标样本片段的braf基因扩增过程中，加入与所述目标样本片段中的野生模板匹配的阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，测序得到与所述目标样本片段对应的测序结果，包括：

5、根据人类基因组序列设计特异性的braf扩增引物；且，基于所述braf扩增引物，根据待检测位点设计所述阻断引物；

6、利用所述braf扩增引物对所述目标样本片段富集过程中加入所述阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，得到特异性片段；

7、对所述特异性片段测序得到所述测序结果。

8、优选地，所述braf扩增引物包括：如seq id no.2所示的上游引物，以及如seq idno.3所示的下游引物。

9、优选地，所述利用所述braf扩增引物对所述目标样本片段富集过程中加入所述阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，得到特异性片段，包括：

10、基于pcr扩增技术，利用braf扩增引物对所述目标样本片段进行pcr扩增，且在所述目标样本片段富集过程中加入所述阻断引物，得到目标扩增产物；

11、对所述目标扩增产物通过凝胶电泳确认扩增结果，并进行割胶纯化且截取得到其中的所述特异性片段。

12、优选地，所述目标扩增产物的获取步骤中，扩增反应体系中包括：

13、所述braf扩增引物中的上游引物和下游引物、模板dna、所述阻断引物、2×hiefftm pcr master mix缓冲液和去离子水。

14、优选地，所述扩增反应体系中的用量分别如下：

15、浓度均为10pmol/μl所述braf扩增引物中的上游引物和下游引物各1μl、模板dna3μl、所述阻断引物1μl、2×hiefftm pcr master mix缓冲液10μl和去离子水4μl。

16、优选地，所述对所述特异性片段测序得到所述测序结果，包括：

17、对所述特异性片段进行纯化后上机测序得到测序数据；

18、对所述测序数据进行分析得到所述测序结果。

19、优选地，所述对所述测序数据进行分析得到所述测序结果，包括：

20、通过minor variant finder软件对待检测样本对应的所述测序数据进行分析，得到所述测序结果。

21、优选地，所述对所述特异性片段进行纯化后上机测序得到测序数据的步骤中，测序反应体系中包括：

22、纯化后的所述特异性片段、bigdyemix混合物、测序引物和去离子水。

23、本发明提供一种低频突变braf基因的检测方法，包括：通过针对于目标样本片段的braf基因扩增过程中，加入与所述目标样本片段中的野生模板匹配的阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，测序得到与所述目标样本片段对应的测序结果。本发明通过在测序模板制作过程中通过阻断引物使扩增过程中braf基因野生型的模板受到抑制，从而相对提高突变型产物所占的比例，以便于达到准确的检测出更低突变率样本的目的，本方法对使用sanger测序法检测低频突变有着重要意义。

技术特征：

1.一种低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述阻断引物的核酸序列如seq id no.1所示。

3.如权利要求1所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述通过针对于目标样本片段的braf基因扩增过程中，加入与所述目标样本片段中的野生模板匹配的阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，测序得到与所述目标样本片段对应的测序结果，包括：

4.如权利要求3所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述braf扩增引物包括：如seq id no.2所示的上游引物，以及如seq id no.3所示的下游引物。

5.如权利要求3所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述利用所述braf扩增引物对所述目标样本片段富集过程中加入所述阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，得到特异性片段，包括：

6.如权利要求5所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述目标扩增产物的获取步骤中，扩增反应体系中包括：

7.如权利要求6所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系中的用量分别如下：

8.如权利要求3所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述对所述特异性片段测序得到所述测序结果，包括：

9.如权利要求8所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述对所述测序数据进行分析得到所述测序结果，包括：

10.如权利要求8所述低频突变braf基因的检测方法，其特征在于，所述对所述特异性片段进行纯化后上机测序得到测序数据的步骤中，测序反应体系中包括：

技术总结
本发明提供一种低频突变BRAF基因的检测方法，属于基因治疗测序技术领域。所述测序方法包括：通过针对于目标样本片段的BRAF基因扩增过程中，加入与所述目标样本片段中的野生模板匹配的阻断引物，使所述阻断引物同变性的所述野生模板相结合，测序得到与所述目标样本片段对应的测序结果。本发明通过在测序模板制作过程中通过阻断引物使扩增过程中BRAF基因野生型的模板受到抑制，从而相对提高突变型产物所占的比例，以便于达到准确的检测出更低突变率样本的目的，本方法对使用Sanger测序法检测低频突变有着重要意义。

技术研发人员：王永琦,张丙凯
受保护的技术使用者：生工生物工程（上海）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17