一种产γ-氨基丁酸(GABA)的重组谷氨酸棒杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产γ-氨基丁酸(gaba)的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于合成生物学。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(gaba)是一种四碳非蛋白质氨基酸，分子式为c4h9no2，分子量为103.12。在自然界中，gaba广泛分布于植物、动物和微生物中。在动物中，它是一种主要的抑制性神经递质。在一些微生物中，对酸性环境的耐受性可以通过胞内积累gaba的来提高。近年来，gaba因其独特的生理特性和广泛的应用而引起了研究者的广泛关注。尽管在化学或生物学上已经进行了许多gaba合成的尝试，但化学合成存在低效率，有机试剂污染的缺点。生物工艺制备gaba因其具有反应过程简单，催化效率高，反应条件温和且符合绿色化学理念的优点，具备广阔的应用前景。在生物工艺制备gaba中，现有文献(enhanced productionof gamma-aminobutyrate(gaba)in recombinant corynebacterium glutamicum strainsfrom empty fruit bunch biosugar solution)公开了利用重组谷氨酸棒杆菌生产gaba，但仍存在着工程菌构建繁琐，工艺复杂，生产周期长，产量低的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产γ-氨基丁酸(gaba)的重组谷氨酸棒杆菌，本发明的重组谷氨酸棒杆菌催化合成γ-氨基丁酸反应周期短，成本低，正常发酵结束后菌体可继续用于全细胞转化，进一步催化l-谷氨酸生产γ-氨基丁酸。

2、本发明的第一个目的是提供一种重组菌株，所述重组菌株以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，表达了谷氨酸脱羧酶gadb以及谷氨酸脱羧酶gdha；所述谷氨酸脱羧酶gadb来源于结核分枝杆菌，所述谷氨酸脱羧酶gdha来源于大肠杆菌。

3、在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌可以是本领域常规选择的谷氨酸棒杆菌宿主，可选的，所述谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌atcc 13032。

4、在一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱羧酶gadb的基因的核苷酸序列如seq idno.1所示；编码所述谷氨酸脱羧酶gdha的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、在一种实施方式中，用于所述表达的载体包括但不限于质粒ptrc99a。

6、本发明还提供了一种生产γ-氨基丁酸的方法，所述方法包括：将所述重组菌株接种于培养基，发酵，收集发酵产物。

7、在一种实施方式中，所述方法包括：

8、(1)一级种子培养：将所述重组菌株接种于一级种子培养基，培养至od600为0.8～2.0，得到一级种子培养液；

9、(2)二级种子培养：将步骤(1)所得一级种子培养液转接至二级种子培养基，培养至od600为5～10，得到二级种子培养液；

10、(3)将步骤(2)所得二级种子培养液转接至发酵培养基，添加终浓度为5-50mm的诱导剂1，培养8-20h后，再以0.1～1.0g/l/h的速度补料诱导剂2，诱导20-40h，发酵生产γ-氨基丁酸；所述诱导剂1包括阿拉伯糖，所述诱导剂2包括乳糖。

11、在一种实施方式中，通过控制转接量，使得所述步骤(2)的二级种子培养基中菌体初始od600为0.1-0.5。

12、在一种实施方式中，通过控制转接量，使得所述步骤(3)的发酵培养基中菌体初始od600为0.1-0.5。

13、在一种实施方式中，所述培养的温度为25-37℃，可选的，所述培养的温度为37℃。

14、在一种实施方式中，所述诱导的温度为25-37℃，可选的，所述诱导的温度为31℃。

15、在一种实施方式中，所述诱导剂2的补料速度为0.2g/l/h。

16、在一种实施方式中，所述方法还包括：在上述步骤(3)所述发酵结束后，收集菌体，将菌体与含有磷酸吡哆醛与l-谷氨酸的反应液混合，于35-42℃全细胞催化反应6-14h。

17、在一种实施方式中，所述全细胞催化的温度为38℃。

18、在一种实施方式中，所述磷酸吡哆醛的浓度为10-30mm。

19、在一种实施方式中，所述菌体在全细胞催化反应体系中的od600为10-40。

20、在一种实施方式中，所述全细胞催化的ph为6.5-7.5。

21、在一种实施方式中，所述一级种子培养基的配方包括：蛋白胨5-15g/l，酵母粉2-8g/l，氯化钠2-8g/l，可选为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l。

22、在一种实施方式中，所述二级种子培养基的配方包括：硫酸铵10-100g/l，磷酸氢二钾0.5-2g/l，尿素1-5g/l，硫酸镁0.2-0.8g/l，蛋白胨10-100g/l，硫酸亚铁0.01-0.05g/l，硫酸锰0.01-0.05g/l，硫胺素100-300μg/l，5‘-磷酸吡哆醛0.1-1mm；可选为硫酸铵50g/l，磷酸氢二钾1g/l，尿素3g/l，硫酸镁0.4g/l，蛋白胨50g/l，硫酸亚铁0.01g/l，硫酸锰0.01g/l，硫胺素200μg/l，5‘-磷酸吡哆醛1mm。

23、在一种实施方式中，所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖10-150g/l，酵母膏10-50g/l，七水合硫酸铵10-50g/l，磷酸二氢钾0.1-1g/l，硫酸镁0.1-1g/l，硫酸锰0.01-0.05g/l，硫酸铁0.01-0.05g/l，生物素0.1-1mg/l，硫胺素盐酸盐0.1-0.5mg/l；可选为葡萄糖90g/l，酵母膏30g/l，七水合硫酸铵30g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸锰0.01g/l，硫酸铁0.01g/l，生物素0.5mg/l，硫胺素盐酸盐0.3mg/l。

24、本发明还提供了所述重组菌株或所述方法在食品或医药领域中的应用。

25、在一种实施方式中，所述应用包括将所述重组菌株或所述方法用于合成γ-氨基丁酸或生产含γ-氨基丁酸的产品。

26、有益效果：

27、与现有技术相比，本发明的具体优势如下：

28、1、本发明的γ-氨基丁酸的重组工程菌，基因工程构建操作简单，生长良好，发酵48h菌体密度od600达到了235，比对照组高10％。

29、2、本发明的γ-氨基丁酸的重组工程菌，发酵48h的γ-氨基丁酸产量达到了41.39g/l。

30、3、本发明进一步利用了发酵48h的菌体全细胞催化生产γ-氨基丁酸，有效提升了γ-氨基丁酸产量以及菌体利用率，转化12h后，全细胞催化产量达到了37.25g/l。

31、4、本发明发酵加全细胞催化总计生产周期为60h，合计gaba产量为78.64g/l，产量显著高于现有技术。

技术特征：

1.一种重组菌株，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，表达了谷氨酸脱羧酶gadb以及谷氨酸脱羧酶gdha；所述谷氨酸脱羧酶gadb来源于结核分枝杆菌，所述谷氨酸脱羧酶gdha来源于大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌atcc 13032。

3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，编码所述谷氨酸脱羧酶gadb的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码所述谷氨酸脱羧酶gdha的基因的核苷酸序列如seqid no.2所示。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，用于所述表达的载体包括质粒ptrc99a。

5.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导的温度为25-37℃。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤(3)所述发酵结束后，收集菌体，将菌体与含有磷酸吡哆醛与l-谷氨酸的反应液混合，于35-42℃全细胞催化反应6-14h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷酸吡哆醛的浓度为10-30mm。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌体在全细胞催化反应体系中的od600为10-40。

10.权利要求1-4任一所述的重组菌株，或权利要求5-9任一所述的方法在食品或医药领域中的应用。

技术总结
本发明涉及一种产γ‑氨基丁酸(GABA)的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于合成生物学技术领域。本发明通过向谷氨酸棒杆菌引入和表达两个异源的谷氨酸脱羧酶基因(大肠杆菌gdhA和结核分枝杆菌gadB)，显著提高了从葡萄糖转化为GABA的产量。此外收集发酵后期菌体用于体外转化谷氨酸，使GABA的得率进一步提高至78.64g/L。

技术研发人员：朱强强,周建龙,宁健飞,蔡立明
受保护的技术使用者：无锡晶海氨基酸股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17