一种基于选择性氨基标记的蛋白质N末端肽富集方法

本发明涉及一种基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法。

背景技术：

1、现有蛋白质n末端肽的富集方法主要有两大类，正向富集与反向富集。正向富集通过在蛋白质n末端引入富集靶标，利用靶标的捕捉实现n末端肽的富集。（cell 2008,134,866–876; analytical chemistry 2013, 85, 6826-6832; bioconjugate chemistry,2020, 31(11): 2476-2481.），此类方法可实现蛋白质n末端肽段的高选择性富集，但是通常在n末端引入标签的效率低，限制了方法的富集效率；此外正向富集方法无法获得内源性修饰的n末端肽段，而生物样品中，大于70%的蛋白的n末端存在内源性的修饰。反向富集通过将非n末端肽键和在聚合物链或固相材料上，或者在非n末端肽上标记亲和基团并采用相应的亲和材料进行吸附等方法，对非末端肽进行去除，从而实现末端肽的富集。因此，反向富集克服了内源性修饰末端无法富集的不足（molecular & cellular proteomics 2012,11, 832-842; nature biotechnology 2010, 28, 281-288）。然而现存反向富集通常需要对蛋白质上的氨基端氨基进行封闭，以避免n末端肽被去除，而所采用的非选择性封闭方式会使蛋白质上赖氨酸的侧链氨基被同时标记，导致赖氨酸位点在后续的蛋白质酶解过程中无法被酶切，致使大量仅能通过赖氨酸酶切产生的性质与质谱鉴定兼容的n末端肽无法被鉴定，最终限制了反向富集的鉴定覆盖度。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中不兼容赖氨酸位点的酶切，无法产生获得赖氨酸酶切产生的n末端肽而导致的n末端鉴定覆盖度不足的问题，本发明提供一种兼容赖氨酸酶切的蛋白质n末端肽富集方法

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，包括封闭蛋白质氨基端氨基、酶解、非n末端肽去除。蛋白质氨基端氨基封闭为选择性封闭，区别蛋白质上氨基端的α-氨基和骨架上赖氨酸侧链的ε-氨基，其仅对蛋白质氨基酸的α-氨基进行选择性标记，不同时标记ε-氨基；蛋白质的酶解兼容赖氨酸特异性的蛋白水解酶，可以对蛋白质的赖氨酸位点进行酶解；非n末端肽去除通过非n端肽氨基端α-氨基的选择性反应，引入可被捕获的功能基团，结合功能材料对非n端肽进行去除，保留n末端肽，包括含有ε-氨基的n末端肽。

4、所述封闭蛋白质氨基端氨基采用蛋白质水平的选择性二甲基化或者选择性丁二酸酐标记进行封闭，选择性二甲基化反应条件为：背景溶液为ph 2.5-3.5的蛋白质变性剂，加入100 mm甲醛和30 mm的氰基硼氢化钠，室温反应25分钟；选择性丁二酸酐标记反应条件为：背景溶液为含蛋白质变性剂的50 mm乙酸钠，加入20 mm丁二酸酐，室温反应10分钟； 所述非n末端肽去除通过α-氨基的选择性标记引入疏水碳链，结合反相色谱材料捕获非n末端肽，反应条件为：背景溶液为60%乙腈，40% ph 3.5-4.5的缓冲液，加入2 mg十六醛，30 mm氰基硼氢化钠，50摄氏度反应45分钟。

5、本发明的有益效果是，本发明对蛋白质氨基的封闭采用选择性化学标记，可区别氨基端α-氨基和赖氨酸侧链ε-氨基，仅标记氨基端α-氨基，使赖氨酸侧链ε-氨基不受影响，从而不限制赖氨酸位点的酶切；并结合基于α-氨基标记的非n末端肽去除方法，实现n末端肽，包括含有ε-氨基的n末端肽的富集。解决了现存反向富集方法与赖氨酸酶切不兼容的缺陷，可获得赖氨酸酶切产生的n末端肽，显著提高蛋白质n末端肽的鉴定覆盖率。

技术特征：

1.一种基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于：所述方法包括封闭蛋白质氨基端氨基、酶解、非n末端肽去除，所述蛋白质氨基端氨基封闭为选择性封闭，区别蛋白质上氨基端的α-氨基和骨架上赖氨酸侧链的ε-氨基，其仅对蛋白质氨基酸的α-氨基进行选择性标记，不同时标记ε-氨基；所述蛋白质的酶解兼容赖氨酸特异性的蛋白水解酶，可以对蛋白质的赖氨酸位点进行酶解；所述非n末端肽去除，通过非n端肽氨基端α-氨基的选择性反应，引入可被捕获的功能基团，结合功能材料对非n端肽进行去除，保留n末端肽，包括含有ε-氨基的n末端肽。

2.根据权利要求1所述的基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于，所述封闭蛋白质氨基端氨基采用蛋白质水平的选择性二甲基化或者选择性丁二酸酐标记进行封闭，选择性二甲基化反应条件为：背景溶液为ph 2.5-3.5的蛋白质变性剂，加入100 mm甲醛和30 mm的氰基硼氢化钠，室温反应25分钟；选择性丁二酸酐标记反应条件为：背景溶液为含蛋白质变性剂的50 mm乙酸钠，加入20 mm丁二酸酐，室温反应10分钟； 所述非n端肽氨基端α-氨基的选择性反应，通过α-氨基的选择性标记引入疏水碳链，结合反相色谱材料捕获非n末端肽，反应条件为：背景溶液为60%乙腈，40% ph 3.5-4.5的缓冲液，加入2mg十六醛，30 mm氰基硼氢化钠，50摄氏度反应45分钟。

3.根据权利要求1所述的基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于，所述蛋白质的n末端 α-氨基采用选择性二甲基化进行封闭（1），然后将蛋白质采用胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸位点上进行酶切（2），酶解产生的n端肽α-氨基无反应活性，非n端肽则暴露出新的α-氨基，通过α-氨基的选择性反应引入带有长碳链的功能基团（3-1），增强非n端肽的疏水性，最后采用反相色谱材料吸附去除非n-端肽段（3-2），从而得到富集的蛋白质n末端肽。具体实验流程如下：

4.根据权利要求1所述的基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于，所述蛋白质的n末端 α-氨基采用选择性二甲基化进行封闭（1），然后将蛋白质采用rlysc在赖氨酸位点上进行酶切（2），酶解产生的n端肽α-氨基无反应活性，非n端肽则暴露出新的α-氨基，通过α-氨基的选择性反应引入带有长碳链的功能基团（3-1），增强非n端肽的疏水性，最后采用反相色谱材料吸附去除非n-端肽段（3-2），从而得到富集的蛋白质n末端肽。具体实验流程如下：

5.根据权利要求1所述的基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于，所述蛋白质的n末端 α-氨基采用选择性丁二酸酐标记进行封闭（1），然后将蛋白质采用胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸位点上进行酶切（2），酶解产生的n端肽α-氨基无反应活性，非n端肽则暴露出新的α-氨基，通过α-氨基的选择性反应引入带有长碳链的功能基团（3-1），增强非n端肽的疏水性，最后采用反相色谱材料吸附去除非n-端肽段（3-2），从而得到富集的蛋白质n末端肽。具体实验流程如下：

6.根据权利要求1所述的基于选择性氨基标记的蛋白质n末端肽富集方法，其特征在于，所述蛋白质的n末端 α-氨基采用选择性丁二酸酐标记进行封闭（1），然后将蛋白质采用rlys c在赖氨酸位点上进行酶切（2），酶解产生的n端肽α-氨基无反应活性，非n端肽则暴露出新的α-氨基，通过α-氨基的选择性反应引入带有长碳链的功能基团（3-1），增强非n端肽的疏水性，最后采用反相色谱材料吸附去除非n-端肽段（3-2），从而得到富集的蛋白质n末端肽。具体实验流程如下：

技术总结
本发明公开了一种基于选择性氨基标记的蛋白质N末端肽富集方法，所述方法包括：封闭蛋白质氨基端氨基、酶解、非N末端肽去除。蛋白质氨基端氨基封闭为选择性封闭，区别蛋白质上氨基端的α‑氨基和骨架上赖氨酸侧链的ε‑氨基，其仅对蛋白质氨基酸的α‑氨基进行选择性标记，不同时标记ε‑氨基；蛋白质的酶解兼容赖氨酸特异性的蛋白水解酶，可以对蛋白质的赖氨酸位点进行酶解；非N末端肽去除通过非N端肽氨基端α‑氨基的选择性反应，引入可被捕获的功能基团，结合功能材料对非N端肽进行去除，保留N末端肽，包括含有ε‑氨基的N末端肽。本发明方法提供一种与赖氨酸位点酶切兼容的N末端肽富集方法，可获得赖氨酸酶切产生的N末端肽，从而显著提高蛋白质N末端肽的鉴定覆盖率。

技术研发人员：陈玲凡,张淑玫,李郁梅,陈燕钦
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7