一种DNA聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法与流程

本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种dna聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法。

背景技术：

1、随着poct诊断场景的需要，等温扩增技术的需求会逐渐增加，等温扩增技术与pcr技术相比，可实现在较低温度下对核酸的扩增，包括lamp技术、rpa技术、sda技术等。此类技术中，因温度条件限制，dna双链难以完全变性，因此需使用链置换聚合酶完成扩增。

2、现有评价链置换聚合酶聚合能力的方法包括：在m13mp18单链环状dna上设计一条引物，如果不具有链置换聚合功能，则在延伸至引物5’位置时终止扩增，如具有链置换聚合功能，则会突破引物5’末端障碍继续延伸，通过碱性电泳检测产物条带大小，即可判断是否存在链置换聚合功能，用同位素标记datp，即可对链置换聚合酶功能进行定量分析，但此法价格昂贵，需要专业检测条件，难以推广使用。此外，公开号为cn108410962a的专利还公开了一种发夹结构，在3’端延长的部分设计一条匹配引物，在靠近5’端的某位置处为一段限制性核酸内切酶的识别序列，若待测酶存在链置换聚合功能，引物可以延伸至模板5’结束，若不存在链置换聚合功能，当延伸至近3’茎环部位置时，则停止扩增，产物用相应的限制性内切酶进行切割后，再进行产物跑胶，通过分析产物大小及条带亮度，即可分析链置换聚合酶活性，但该法需要在扩增结束后再进行一步酶切，酶切结束后跑胶，步骤太过复杂，会对检测灵敏度限制，具有定量不准、检测时间较长、开放式检测环境容易污染等问题。因此需要一种无污染、操作简便、成本低且能够定量的链置换聚合酶酶活检测方法。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种dna聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法，以解决现有技术存在的分析时间长，成本高，难以推广等问题。

2、本发明采用的技术方案如下：一种dna聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法，包括以下步骤：

3、a、配置探针反应体系，以不同梯度探针浓度为横坐标，以各浓度探针荧光稳定期的平均荧光增量y1为纵坐标，建立探针摩尔量与荧光增量的标准曲线；

4、b、配置分子信标mb反应体系，获得不同浓度梯度的链置换dna聚合酶一定循环数对应的平均荧光增量y2，将荧光增量y2带入步骤a中的标准曲线，计算得到不同反应时间下，不同浓度梯度对应稀释倍数的链置换dna聚合酶打开的分子信标mb量；

5、c、获得一定循环数内对应时间点打开的分子信标量与1/链置换dna聚合酶不同稀释倍数的“s”型散点图，选取“s”型散点图中近线性区域以及不同实验间变异系数最小对应的时间区域，作为链置换dna聚合酶聚合活性定量的分析范围，建立该分析范围内不同时间点下打开的分子信标量与链置换dan聚合酶不同稀释倍数之间的多条线性曲线，其中线性曲线以1/链置换dna聚合酶稀释倍数为横坐标，以对应打开的分子信标量为纵坐标，1/链置换dna聚合酶稀释倍数表示为：链置换dna聚合酶稀释倍数的倒数；

6、d、以时间为横坐标，以步骤c中获得的多条线性曲线斜率为纵坐标进行线性拟合，获得“打开分子信标量”*“链置换dna聚合酶稀释倍数”与时间之间的线性曲线，其中线性曲线的斜率为k，所述k的单位为：分子信标量*链置换dna聚合酶的稀释倍数/时间；

7、e、链置换dna聚合酶酶活计算，1μl待测酶的酶活＝k*酶活定义时间/体系加样体积。

8、进一步，所述分子信标mb为发夹结构，分子信标mb的5’至3’端包括一个茎环结构区和一个单链区，5’端连接有发光基团，距离5’端第32位t碱基上连接有猝灭基团，分子信标mb的5’末端进行了c3 spacer封闭修饰。

9、进一步，所述发光基团为fam基团，所述猝灭基团为dabcyl。

10、进一步，所述分子信标mb的序列为：

11、5’c3spacer-acga[fam-dt]cgtagctcttttttgagctacgatcg[dabcyl-dt]ggcgtcatggtctccagtgg 3’。

12、进一步，分子信标mb反应体系包括：分子信标mb、与分子信标3’端单链区互补的引物mb-f、buffer、dntps、链置换dna聚合酶、mgoac，所述buffer包括tris-hcl、醋酸钾、mgoac；

13、mb-f的序列为：ccactggagaccatgacgcc。

14、进一步，所述探针反应体系包括：探针标曲-f1、探针标曲-f2、buffer、链置换dna聚合酶储存液，所述buffer包括tris-hcl、醋酸钾、mgoac；

15、探针标曲-f1的序列为：

16、fam-aacccatgtaccgtaacactgagtttcgtc；

17、探针标曲-f2的序列为：

18、cagtacaaactacaacgcctgtagcattccaca-dabcyl。

19、进一步，在步骤a中，探针荧光稳定期为反应的第20个循环。

20、进一步，在步骤b中，一定循环数是指反应的30个循环；不同浓度梯度为500ng/μl、333ng/μl、222ng/μl、14ng/μl、99ng/μl、66ng/μl，不同浓度梯度对应的稀释倍数为7.59375、5.0625、3.375、2.25、1.5、1，不同稀释倍数的倒数为0.13、0.20、0.30、0.44、0.67、1.00。

21、进一步，在步骤c中，链置换dna聚合酶聚合活性定量的分析范围为210s-360s

22、进一步，待测链置换dna聚合酶比活计算公式为：待测酶比活＝1μl原酶液酶活/1μl原酶液质量。

23、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

24、1、本发明设计的分子信标mb具有特异性，可以筛选出适合等温扩增的仅保留5’-3’聚合活性的原料酶，避免因特异性不强，筛选到其他类型聚合酶，导致等温扩增体系性能不佳，从原料筛选上保证了等温扩增反应性能；

25、2、本发明在建立链置换dna聚合酶链置换聚合活性定量的分析范围时，以获得的打开的分子信标量与1/链置换dna聚合酶不同稀释倍数的散点图中近线性区域，结合不同实验间变异系数最小的共同时间范围作为链置换dna聚合酶聚合活性定量的分析范围，从而建立链置换dna聚合酶链置换聚合活性定量检测的线性曲线，该方法相比仅仅考虑散点图线性区域进行曲线拟合更加合理及严谨，利用本发明建立的线性曲线，保证了酶活定义中的30min为绝对的起始反应的30min，而非上机检测时第30min的定量，能够实现体系反应相应时间的绝对定量，而非现有技术中的某一检测时间点的定量；

26、3、本发明的检测方法相对于现有的其它检测方法，具有操作简单、定量准确、可推广使用的优点。

技术特征：

1.一种dna聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述分子信标mb为发夹结构，分子信标mb的5’至3’端包括一个茎环结构区和一个单链区，5’端连接有发光基团，距离5’端第32位t碱基上连接有猝灭基团，分子信标mb的5’末端进行了c3 spacer封闭修饰。

3.如权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于，所述发光基团为fam基团，所述猝灭基团为dabcyl。

4.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述分子信标mb的序列为：5’c3spacer-acga[fam-dt]cgtagctcttttttgagctacgatcg[dabcyl-dt]ggcgtcatggtctccagtgg 3’。

5.如权利要求1-4任一所述的定量检测方法，其特征在于，分子信标mb反应体系包括：分子信标mb、与分子信标3’端单链区互补的引物mb-f、buffer、dntps、链置换dna聚合酶、mgoac，所述buffer包括tris-hcl、醋酸钾、mgoac；

6.如权利要求5所述的定量检测方法，其特征在于，所述探针反应体系包括：探针标曲-f1、探针标曲-f2、buffer、链置换dna聚合酶储存液，所述buffer包括tris-hcl、醋酸钾、mgoac；

7.如权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，在步骤a中，探针荧光稳定期为反应的第20个循环。

8.如权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，在步骤b中，一定循环数是指反应的30个循环；不同浓度梯度为500ng/μl、333ng/μl、222ng/μl、14ng/μl、99ng/μl、66ng/μl，不同浓度梯度对应的稀释倍数为7.59375、5.0625、3.375、2.25、1.5、1，不同稀释倍数的倒数为0.13、0.20、0.30、0.44、0.67、1.00。

9.如权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，在步骤c中，链置换dna聚合酶聚合活性定量的分析范围为210s-360s。

10.如权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，待测链置换dna聚合酶比活计算公式为：待测酶比活＝1μl原酶液酶活/1μl原酶液质量。

技术总结
本发明公开了一种DNA聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法，通过设计链置换DNA聚合酶特异性分子信标MB，和与分子信标MB荧光量对等的探针标曲‑F1、探针标曲‑F2，利用不同浓度梯度探针和荧光增量建立标准曲线，并利用不同稀释浓度梯度的分子信标和荧光增量的关系，计算得到不同时间下不同稀释浓度链置换DNA聚合酶打开分子信标并释放荧光的分子信标量，然后建立分子信标打开量、链置换DNA聚合酶稀释倍数与时间的线性曲线，得到线性曲线的斜率K值，然后利用K值计算得到在37℃，30min打开1pmol分子信标所需的酶量。本发明的方法解决了现有技术存在的分析时间长，成本高，难以推广的问题。

技术研发人员：朱牧孜,董宇,杨琳琳,刘梦昕,李红东,李明
受保护的技术使用者：西安天隆科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24