一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法

本发明属于化学药品原料药、制剂制造，具体涉及一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法。

背景技术：

1、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，cdca)是动物体胆汁中的一种生化物质，是天然初级胆汁酸。在人、畜、禽的胆汁中广泛存在，是鸡、鸭和鹅等家禽胆汁中的主要有机成分。临床上不仅用做溶解胆结石和纠正饱和胆汁的药物，还具有显著的平喘、抗炎、镇咳、降血脂和祛痰的作用。鹅去氧胆酸阻碍机体吸收胆固醇，减少胆固醇的产生，使胆汁内胆固醇的含量降低来抵抗胆结石的生成，并帮助机体溶解已生成的胆结石，降低胆固醇的饱和度。熊胆酸(udca)是一种国内比较名贵的中药，在熊去氧胆酸的制备工艺中，cdca与udca互为立体异构体，仅结构中7位羟基的立体构象不同，医药生产中常常以cdca为原料合成获得udca。临床上医治胆疾和消化道疾病的药物里常会出现熊去氧胆酸。因此制备大量的鹅去氧胆酸有利于克服熊胆天然来源不足的缺陷，有利于熊去氧胆酸的制备。

2、大量的专利和文献报道了关于鹅去氧胆酸的分离纯化方法，其中较为常用的是钡盐和钙盐沉淀法等，例如，中国专利cn101143886公开的“禽类胆汁中鹅去氧胆酸的非有机溶剂提取法”：包括如下步骤：a.皂化反应：将禽胆汁与氢氧化钠按一定比例煮沸进行皂化，皂化时间20-24小时；b.中和反应；皂化液用盐酸中和及调节ph2-4；沉淀得总胆汁酸；c.钙盐沉淀：将总胆汁酸加氢氧钠溶液溶解，加活性炭，回流，过滤，滤液加10％-14％的氯化钙，得钙盐沉淀物；d.脱钙：钙盐按比例加入碳酸钠10％-15％，加热回流1-3小时，滤液用5％-10％的盐酸液调节ph2.0-3.5得沉淀：e.收集沉淀物，真空干燥，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品。

3、但是现有技术的这些传统方法，提取方法都比较复杂且成本较高，限制了其开发利用，另外，传统工艺需要使用强碱下长时间的皂化反应，使用强碱且耗能高，急需研究安全、高效、绿色的胆汁酸提取替代工艺。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种高效提取鹅去氧胆酸的方法，采用生物发酵酶解的方法，工艺条件温和，提取效率高，工艺过程更加绿色和环保。

2、为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，包括以下步骤：

4、(1)制备微生物菌液：将两种微生物菌株活化后，分别接种到lb液体培养基中，35-37℃、180rpm-200rpm下培养10-12h，得到两种菌的种子液；

5、(2)将两种菌的种子液按照体积比1:1混合后，取10ml混合菌液接种到100ml液体发酵培养基中，混合培养24-36h，培养完成将发酵液于4℃-6℃冷冻离心收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀，再离心得到菌体沉淀，加磷酸缓冲液制成od600为1.0-1.5的菌悬液，将菌悬液在冰浴中超声破碎，得到粗酶液；

6、(3)胆汁预处理：取动物胆汁，按照胆汁量体积添加粗酶液5-10ml/l，混合均匀，在35-37℃下，反应3-5h，得到预处理胆汁液；

7、(4)将预处理胆汁液中加入乙酸丁酯，混合均匀静置分层，取乙酸丁酯层，再加入碱液进行萃取，下层溶液用酸液调节ph为3-4，此时，胆酸类物质形成沉淀析出，过滤去除废水，收集固体，水洗干燥，得鹅去氧胆酸粗品；

8、(5)纯化：将得到的鹅去氧胆酸粗品，加入二氯甲烷，二氯甲烷用量与鹅去氧胆酸粗品的固液比为(9-11)ml：1g，升温搅拌，回流反应0.5-1小时，缓慢降温至0-5℃，搅拌结晶1-2小时，过滤，得鹅去氧胆酸精品。

9、进一步的，步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(lactobacillusplantarum)和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，所述干酪乳杆菌的保藏编号为cgmcc no.1.8727，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年11月10日；所述植物乳杆菌的的保藏编号为cgmcc no.1.12974，原始保藏日期为2014年9月5日。

10、更进一步的，菌株活化的方法为：取冷冻保藏的菌株，解冻后接种于lb固体培养基，37±1℃活化培养24h-36h，得到活化的菌株。lb固体培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100ml，调ph至5-6，加琼脂1.5％-2.0％，高压灭菌。

11、更进一步的，步骤(1)lb液体培养基的组成为：nacl10g/l，酵母膏5g/l，胰蛋白胨10g/l，蒸馏水1000ml，调节ph5-6。

12、本发明两种菌株均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心开放购买，无需进行重复保藏。

13、进一步的，步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5ml、na2hpo41g、mnso40.025g、mgso4·7h2o0.05g、蒸馏水500ml，调节ph5-6。

14、进一步的，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁、猪胆汁和鸭胆汁中的一种或者几种。

15、更进一步的，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。

16、进一步的，步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液或者碳酸氢钠溶液，质量浓度为10-20％。

17、进一步的，步骤(4)所述酸液为稀盐酸或稀硫酸，质量浓度为10-20％。

18、进一步的，步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。

19、胆盐水解酶(bile salt hydrolase，bsh)是微生物在生长过程中产生的代谢产物，通常为胞内酶，胆汁中结合态形式胆盐可被胆盐水解酶解离为游离态形式存在，从而实现胆汁中鹅去氧胆酸的分离和提纯。

20、有益效果：本发明筛选两株产活性胆盐水解酶的微生物菌株，两者等比例混合发酵后，快速产生高活性的胆盐水解酶，可将动物胆汁中的结合态形式胆盐高效的解离为游离态形式，更利于后续鹅去氧胆酸的分离和纯化。本发明工艺方法简单易操作，可以用作药学研究机构对其进行生物活性，以及毒理药理研究。

技术特征：

1.一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(1)所述两种微生物菌株分别为干酪乳杆菌(lactobacillus plantarum)和植物乳杆菌(

3.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(2)液体发酵培养基的组成为：蛋白陈6g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖10g、吐温80 0.5ml、na2hpo41g、mnso40.025g、mgso4·7h2o0.05g、蒸馏水500ml，调节ph5-6。

4.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁、猪胆汁和鸭胆汁中的一种或者几种。

5.根据权利要求4所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述动物胆汁为鸡胆汁。

6.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述碱液为氢氧化钠溶液或者碳酸氢钠溶液。

7.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述酸液为稀盐酸或稀硫酸。

8.根据权利要求1所述从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤(4)预处理胆汁液、乙酸丁酯、碱液的体积比为3：2：2。

技术总结
本发明公开一种从动物胆汁中提取鹅去氧胆酸的方法，属于化学药品原料药、制剂制造技术领域。本发明筛选两株产活性胆盐水解酶的微生物菌株，两者等比例混合发酵后，快速产生高活性的胆盐水解酶，可将动物胆汁中的结合态形式胆盐高效的解离为游离态形式，更利于后续鹅去氧胆酸的分离和纯化。本发明工艺方法简单易操作，可以用作药学研究机构对其进行生物活性，以及毒理药理研究。

技术研发人员：史晓委,鞠文广,王兆雪,郭天廷,赵志龙
受保护的技术使用者：临沂大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24