甘薯块根类胡萝卜素代谢调控因子及其植物表达载体的应用

本发明涉及一种甘薯类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3和含有该基因的重组超表达载体，还涉及该基因在培育高类胡萝卜素甘薯中的应用和方法属于基因工程。

背景技术：

1、甘薯是一种世界范围内广泛种植的重要粮食作物。类胡萝卜素是甘薯重要的营养物质之一，可用于改善视力和缓解维生素a缺乏症。培育高类胡萝卜素甘薯是当前甘薯育种的热点之一。传统的育种方法周期长、耗资大、效果不显著等问题已不能满足现代甘薯生产的需求。近年来，随着转基因技术的日益成熟和完善，基因工程技术已被广泛应用于品种改良和育种。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种供甘薯类胡萝卜素代谢控基因ibmbp3；本发明的目的之二在于提供含有甘薯类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3的重组超表达载体；本发明的目的之三在于提供含有重组超表达载体的微生物转化体；本发明的目的之四在于提供甘薯类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3在培育高类胡萝卜素甘薯品种中的应用；本发明的目的之五在于提供培育高类胡萝卜素甘薯品种的方法。

2、本发明提供一种甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3，其核苷酸序列如seqid no.3所示。

3、本发明还提供含有上述甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3的重组超表达载体。

4、如上所述重组超表达载体的制备方法，包括以下步骤：

5、1)通过ta克隆将如seq id no.3所示的核苷酸序列插入pcrtm8/gw/topo载体；

6、2)通过gateway系统将如seq id no.3所示的核苷酸序列插入植物表达载体pgwb8，获得含35s启动子-ibmbp3-nos终止子表达框的重组质粒pgwb8::ibmbp3。

7、本发明更进一步地提供含有上述重组超表达载体的eha105微生物转化体。

8、上述的微生物转化体，采用根癌农杆菌eha105。

9、上述微生物转化体的制备方法，包括以下步骤：

10、(1)将重组超表达载体的质粒转化根癌农杆菌eha105感受态，菌液均匀涂在含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素yeb固体培养基中(ph7.2)，28℃黑暗条件下倒置培养2～2.5天，至长出单菌落；

11、(2)以seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列为引物，鉴定单菌落的阳性；

12、(3)用含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素、50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基(ph7.2)在28℃、黑暗、200rpm条件下培养至菌液od600为1.8～2.0，提取质粒；

13、(4)以seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列为引物进行pcr鉴定，阳性克隆即为微生物转化体。

14、本发明还提供述甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3在培育高类胡萝卜素甘薯品种中的应用。

15、一种培育高类胡萝卜素甘薯品种的方法，包括以下步骤：

16、a.构建含如seq id no.3所示核苷酸序列的重组超表达载体，然后转化微生物菌种eha105，获得转化体工程菌；

17、b.通过转化体工程菌介导转化甘薯茎尖愈伤获得转基因甘薯。

18、本发明筛选获得ibmbp3是类胡萝卜素代谢正调控因子，将ibmbp3基因超表达于甘薯中，获得了类胡萝卜素升高的转基因甘薯株系。利用基因工程技术手段快速获取稳定遗传、性状优良的甘薯新品种必将是当前和未来的发展趋势。

19、具体的，在所述步骤b中，利用超生波将步骤a所得工程菌侵染甘薯愈伤，然后在含有2.0mg/l 2,4-d和100mm/l乙酰丁香酮的ms培养基(ph 5.8)28℃、黑暗条件下共培养3d；转移愈伤至三角瓶中，用含有2.0mg/l 2,4-d的液体ms培养基清洗，再将愈伤转移至2.0mg/l 2,4-d和300mg/l头孢霉素的ms液体培养基中，避光室温慢摇1h；再将愈伤转移至含有2.0mg/l 2,4-d和200mg/l头孢霉素的ms固体培养基上筛选，约20天后挑选愈伤状态良好的愈伤放入含有200mg/l头孢霉素、10mg/l潮霉素ms培养基上，筛选约2个月至愈伤分化成绿色；再放入ms培养基上至分化成苗，即得转化的甘薯。

20、与现有技术相比，本发明获得了甘薯类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3，并将ibmbp3的编码区重组于表达载体pgwb8中，将该重组载体转入甘薯后所得的阳性转基因甘薯植株中ibmbp3基因的表达与非转基因植株相比有显著的提高，且转基因甘薯块根的类胡萝卜素含量与非转基因植株相比也显著增强；与传统育种方法如通过杂交等相比，本发明采用基因工程技术，高效且可稳定遗传地提高了甘薯块根的类胡萝卜素含量，为甘薯的品种改良做出了积极的探索，具有良好的市场应用前景。

技术特征：

1.一种甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.含有权利要求1所述甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3的重组超表达载体。

3.如权利要求2所述重组超表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.含有权利要求2所述重组超表达载体的eha105微生物转化体。

5.根据权利要求4所述的微生物转化体，其特征在于：所述微生物转化载体为根癌农杆菌eha105。

6.如权利要求4所述微生物转化体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求1所述甘薯块根类胡萝卜素代谢调控基因ibmbp3在培育高类胡萝卜素甘薯品种中的应用。

8.一种培育高类胡萝卜素甘薯品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述培育高类胡萝卜素甘薯品种的方法，其特征在于，所述步骤b中，利用超生波将步骤a所得工程菌侵染甘薯愈伤，然后在含有2.0 mg/l 2,4-d和100 mm/l乙酰丁香酮的ms培养基28℃、黑暗条件下共培养3 d；转移愈伤至三角瓶中，用含有2.0 mg/l2,4-d的液体ms培养基清洗，再将愈伤转移至2.0 mg/l 2,4-d和300 mg/l头孢霉素的ms液体培养基中，避光室温慢摇1h；再将愈伤转移至含有2.0 mg/l 2,4-d和200 mg/l头孢霉素的ms固体培养基上筛选，约20天后挑选愈伤状态良好的愈伤放入含有200 mg/l头孢霉素、10 mg/l潮霉素ms培养基上，筛选约2个月至愈伤分化成绿色；再放入ms培养基上至分化成苗，即得转化的甘薯。

技术总结
本发明提出了一种甘薯块根类胡萝卜素代谢调控因子及其植物表达载体。甘薯块根类胡萝卜素代谢调控因子IbMBP3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，将该基因序列构建到超表达载体后，通过农杆菌介导转化甘薯茎尖愈伤获得转基因甘薯，转化后的甘薯块根类胡萝卜素积累显著上升，因此可以通过超表达IbMBP3基因获得高类胡萝卜素新品种，具有良好的市场应用前景，同时为其它植物高类胡萝卜素新品种的培育和筛选提供了参考和借鉴。

技术研发人员：董婷婷,杨一宇,张渝皎,向金会,朱嘉豪,李典,李宗芸,朱明库,张立明
受保护的技术使用者：江苏师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24