本发明涉及生物工程，具体为一种酰胺水解酶工程菌构建方法。
背景技术：
1、酰胺水解酶在生物体内的作用非常广泛。在蛋白质代谢中，酰胺水解酶能够将蛋白质中的酰胺分解成相应的酸和胺，从而释放出氮原子和碳骨架。这些氮原子和碳骨架可以被利用来合成新的蛋白质，从而维持生物体内蛋白质的平衡。在脂肪代谢中，酰胺水解酶能够将脂肪酰胺分解成相应的脂肪酸和胺，从而释放出能量。在糖代谢中，酰胺水解酶能够参与糖酰胺的代谢，从而维持血糖水平的平衡。
2、天然环肽类抗生素往往存在溶血毒性，微生物产生的酰胺水解酶可以水解达托霉素、阿库来菌素a等环肽类抗生素的酰胺键侧链，再由化学半合成修饰，以降低毒性。据报道，由ecb制备脱侧链，ecb母核主要依靠放线菌的微生物转化，但主要存在转化率较低和成本高的问题，缺少可以应用于工业化生产的酰胺水解酶的制备方法。因此，如何提供一种可以大规模生产酰胺水解酶的方法，操作简便，生产效率高，已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种酰胺水解酶工程菌构建方法，通过构建的基因工程菌可以水解ecb底物生成脱侧链母核，转化率高于犹他放线菌，且培养成本大大低于犹他放线菌，解决了上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种酰胺水解酶工程菌构建方法，包括以下步骤：从培养的犹他放线菌基因组中克隆到ecb酰胺水解酶基因及其启动子序列，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因克隆到表达载体，并在模式链霉菌s.lioidanstk24中表达。
3、优选的，所述培养犹他放线菌的具体步骤如下：对最初从土壤样品中分离的犹他游动放线菌野生型菌株进行了一系列的诱变实验，在菌株开发的过程中，具有优秀属性的多个突变体被选作新的生产菌株并转入大规模生产。
4、优选的，所述诱变实验包括若干个诱变和选择步骤，在小规模摇瓶实验中对经历诱变处理而幸存的培养犹他放线菌随机选择，检验其ecb酰胺侧链的水解能力，选择该诱变处理中获得的最佳突变体克隆用于接下来的诱变步骤，几个这样的诱变和选择步骤导致ecb酰胺侧链的水解能力的逐渐提高化学诱变和物理诱变。
5、优选的，所述诱变处理包括化学诱变和物理诱变，采用烷化剂或用作移码诱变剂的嵌入染料作为化学诱变，用365nm的uv光对细胞进行物理处理以引起物理诱变，在适合的缓冲液体系中使用菌丝体的片段进行诱变处理。
6、优选的，所述金属β-内酰胺酶基因的来源菌为大肠杆菌。
7、优选的，所述金属β-内酰胺酶基因的获取方法如下：经ecor i/bamh i双酶切，从大肠杆菌细胞中提取金属β-内酰胺酶dna，过程中添加mg2+。
8、优选的，所述表达载体采用克隆质粒psp72，pcr产物经割胶回收后，经ecort/xbal双酶切，切出若干个裂开的末端，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因连入克隆质粒psp72。
9、优选的，所述基因连入克隆质粒psp72过程中使用t4 dna连接酶，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因形成一个完整的dna分子。
10、优选的，所述ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因按照3:1的数量克隆到表达载体上。
11、优选的，所述在模式链霉菌s.lioidans tk24中表达的具体步骤如下：选取阳性接合子和s.lividans tk24野生株分别接种于高氏培养基斜面，28℃静置培养10d，将以上菌种自斜面接种于30ml/250ml种子液中振荡培养48h，种子液以10％的接种量转接于30ml/250ml发酵培养基中，振荡培养5d放瓶，取发酵培养液用去离子水洗涤数次，离心沉淀后，用30ml ph 6.8，浓度0.1mol/l磷酸缓冲液悬浮，加入溶解ecb的dmso混匀，进行转化反应5h。
12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
13、本发明提出的一种酰胺水解酶工程菌构建方法，采用犹他放线菌基因组中克隆到ecb酰胺水解酶基因及其启动子序列，以及金属β-内酰胺酶基因，控制ecb酰胺水解酶基因和金属β-内酰胺酶基因的数量比，并在模式链霉菌s.lioidans tk24中表达，构建的基因工程菌可以水解ecb底物生成脱侧链母核，转化率高于犹他放线菌，且培养成本大大低于犹他放线菌。
1.一种酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：从培养的犹他放线菌基因组中克隆到ecb酰胺水解酶基因及其启动子序列，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因克隆到表达载体，并在模式链霉菌s.lioidans tk24中表达。
2.根据权利要求1所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述培养犹他放线菌的具体步骤如下：对最初从土壤样品中分离的犹他游动放线菌野生型菌株进行了诱变实验，在菌株开发的过程中，具有优秀属性的多个突变体被选作新的生产菌株并转入大规模生产。
3.根据权利要求2所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述诱变实验包括若干个诱变和选择步骤，在小规模摇瓶实验中对经历诱变处理而幸存的培养犹他放线菌随机选择，检验其ecb酰胺侧链的水解能力，选择该诱变处理中获得的最佳突变体克隆用于接下来的诱变步骤。
4.根据权利要求3所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述诱变处理包括化学诱变和物理诱变，采用烷化剂或用作移码诱变剂的嵌入染料作为化学诱变，采用365nm的uv光对细胞进行物理处理以引起物理诱变，在适合的缓冲液体系中使用菌丝体的片段进行诱变处理。
5.根据权利要求4所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述金属β-内酰胺酶基因的来源菌为大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述金属β-内酰胺酶基因的获取方法如下：经ecor i/bamh i双酶切，从大肠杆菌细胞中提取金属β-内酰胺酶dna，过程中添加mg2+。
7.根据权利要求6所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述表达载体采用克隆质粒psp72，pcr产物经割胶回收后，经ecort/xba l双酶切，切出若干个裂开的末端，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因连入克隆质粒psp72。
8.根据权利要求7所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述基因连入克隆质粒psp72过程中使用t4 dna连接酶，将ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因形成一个完整的dna分子。
9.根据权利要求8所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述ecb酰胺水解酶基因与金属β-内酰胺酶基因按照3:1的数量克隆到表达载体上。
10.根据权利要求8所述的酰胺水解酶工程菌构建方法，其特征在于：所述在模式链霉菌s.lioidans tk24中表达的具体步骤如下：选取阳性接合子和s.lividans tk24野生株分别接种于高氏培养基斜面，28℃静置培养10d，将以上菌种自斜面接种于30ml/250ml种子液中振荡培养48h，种子液以10％的接种量转接于30ml/250ml发酵培养基中，振荡培养5d放瓶，取发酵培养液用去离子水洗涤数次，离心沉淀后，用30ml ph 6.8，浓度0.1mol/l磷酸缓冲液悬浮，加入溶解ecb的dmso混匀，进行转化反应5h。