一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组、检测方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种呼吸道病毒检测的引物探针组、检测方法及其应用。

背景技术：

1、呼吸道感染的高发病率和多变性，特别容易造成大规模的发病率和死亡率。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。常见的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、冠状病毒等。呼吸道感染临床症状多样，感染的病根难以明确，单种病原体可引起的多种的临床症状，相同的临床症状又可能会是由多种病原体导致的。了解呼吸道感染的病原学，并对病原体进行早期、快速、准确的筛查对呼吸道感染性疾病的控制至关重要。

2、由于传统的病毒分离培养方法在进行呼吸道病原体检测时检测速度慢(2～5d)、通量低，对重症呼吸道感染患者来说会延误宝贵救治时间，pcr技术检测靶基因便捷快速、不需要昂贵的仪器和试剂、操作简单，非常适用于临床样本的大规模筛检。但传统pcr检测以单荧光通道检测单一靶标为主，通量较小，检测多个靶标需进行多次检测，耗时长且检测效率低是呼吸道病毒检测中的常见问题，目前常见的呼吸道病毒检测方法有病毒分离培养方法、抗原法和荧光定量pcr检测技术，无法同时满足快速、高通量、准确、灵敏度高的要求。

3、中国公开授权发明：cn116287452a公开了一种检测呼吸道病毒的半巢式pcr引物组合、试剂盒，其包括：用于检测乙型流感病毒的第一引物组，用于检测呼吸道合胞病毒的第二引物组，用于检测新型冠状病毒的第三引物组，采用半巢式pcr引物组合和试剂盒进行检测具有检测特异性高、检测时间短和价格低的技术优势，但是检测项目较少，单荧光通道仅检测单一靶标，且操作繁琐、检测时间长。

4、中国公开授权发明：cn115852049a公开了一种检测新冠、呼吸道合胞、流感和呼吸道腺病毒的试剂盒及其应用，所述检测试剂盒包括引物和探针，所述引物和探针靶向新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道腺病毒，但是检测项目较少，单荧光通道仅检测单一靶标，且不含内参。

5、为此，提出一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组、检测方法及其应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组、检测方法及其应用，以解决或缓解现有技术中存在的技术问题，至少提供有益的选择。

2、本发明实施例的技术方案是这样实现的：一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针；

3、其中，所述上游引物的核苷酸序列为seq id no：1、seq id no：4、seq id no：7、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：17、seq id no：20、seq id no：23和/或seq id no：26；

4、其中，所述下游引物的核苷酸序列为seq id no：2、seq id no：5、seq id no：8、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：18、seq id no：21、seq id no：24和/或seq id no：27；

5、其中，所述探针的核苷酸序列为seq id no：3、seq id no：6、seq id no：9、seq idno：16、seq id no：19、seq id no：22、seq id no：25和/或seq id no：28。

6、进一步优选的，引物探针组的检测方法，包括以下步骤：

7、s1、提取检测样品中的核酸；

8、s2、配置pcr扩增反应体系；

9、s3、pcr扩增及熔解曲线获取；

10、s4、数据分析－对结果进行判读。

11、进一步优选的，所述s1中，样品为新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型和呼吸道腺病毒样品中的至少一种。

12、进一步优选的，所述s2中，取s1中提取的核酸作为模板，并使用超纯水作为无模板对照；

13、其中，pcr扩增反应体系是采用上游引物、下游引物和探针构建，包含5×pcr反应液1份、上游引物20－30nm、下游引物120－180nm、探针40－60nm、模板4－6μl，超纯水加至20μl。

14、进一步优选的，所述s3中，将pcr管盖封后混匀样本，离心后转移荧光定量pcr仪中进行pcr扩增；

15、其中，pcr仪的扩增程序为：55℃逆转录15分钟；95℃预变性30秒；95℃变性10秒，60℃退火延伸30秒，共进行45个循环，不采集荧光；95℃变性2分钟，50℃退火延伸1分钟；50～80℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.04℃，采集荧光，获得熔解曲线。

16、进一步优选的，所述s4中，利用熔解曲线的tm值对结果进行判读；

17、其中，判读包括靶标、荧光通道和tm值；

18、其中，靶标包括新型冠状病毒orf1ab基因、新型冠状病毒n基因、甲型流感病毒、人副流感病毒1、2、3型、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒、内参hrpp30基因中的至少一种；

19、其中，荧光通道包括fam、vic、cy5中的至少一种。

20、进一步优选的，引物探针组或引物探针组的检测方法在呼吸道病毒检测的应用，所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型、呼吸道腺病毒和内参基因中的至少一种。

21、进一步优选的，检测范围为：1.00e+05～1.00e+03copies/ml，检测灵敏度为：1.00e+03copies/ml。

22、进一步优选的，引物探针组或引物探针组的检测方法在制备呼吸道病毒检测产品中的应用。

23、进一步优选的，检测范围为：1.00e+05～1.00e+03copies/ml，检测灵敏度为：1.00e+03copies/ml。

24、本发明实施例由于采用以上技术方案，其具有以下优点：本发明通过利用上游引物、下游引物和探针对pcr扩增反应体系进行构建，利用荧光定量pcr仪进行检测获得熔解曲线，然后根据熔解峰温度便可判读检测结果，且单通道可检测2－3个靶标，提高了检测效率，实现了2小时内便可完成对新型冠状、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型和呼吸道腺病毒六项呼吸道病毒的检测。

25、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。

技术特征：

1.一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探针；

2.根据权利要求1所述的引物探针组的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的引物探针组的检测方法，其特征在于：所述s1中，样品为新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型和呼吸道腺病毒样品中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的引物探针组的检测方法，其特征在于：所述s2中，取s1中提取的核酸作为模板，并使用超纯水作为无模板对照；

5.根据权利要求2所述的引物探针组的检测方法，其特征在于：所述s3中，将pcr管盖封后混匀样本，离心后转移荧光定量pcr仪中进行pcr扩增；

6.根据权利要求2所述的引物探针组的检测方法，其特征在于：所述s4中，利用熔解曲线的tm值对结果进行判读；

7.根据权利要求1所述的引物探针组或权利要求2－6任一项所述的引物探针组的检测方法在呼吸道病毒检测的应用，其特征在于：所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型、呼吸道腺病毒和内参基因中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：检测范围为：1.00e+05～1.00e+03copies/ml，检测灵敏度为：1.00e+03copies/ml。

9.根据权利要求1所述的引物探针组或权利要求2－6任一项所述的引物探针组的检测方法在制备呼吸道病毒检测产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：检测范围为：1.00e+05～1.00e+03copies/ml，检测灵敏度为：1.00e+03copies/ml。

技术总结
本发明提供了一种基于熔解曲线的呼吸道病毒检测的引物探针组、检测方法及其应用，包括上游引物、下游引物和探针；其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23和/或SEQ ID NO：26；本发明通过利用上游引物、下游引物和探针对PCR扩增反应体系进行构建，利用荧光定量PCR仪进行检测获得熔解曲线，然后根据熔解峰温度便可判读检测结果，且单通道可检测2－3个靶标，提高了检测效率，实现了2小时内便可完成对新型冠状、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒1、2、3型和呼吸道腺病毒六项呼吸道病毒的检测。

技术研发人员：文媛怡,秦明明,田金金,杨华,黄柱亨,何广斌,刘华勇
受保护的技术使用者：广州利德曼医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8