一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法与流程

本发明属于水产生物，涉及一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法。

背景技术：

1、精巢间质细胞最早由德国franz leydig在大鼠精巢中发现，又被称为精巢leydig细胞。该类型细胞是成年雄性体内雄激素合成主要细胞，其合成量约占血液雄激素总量95％，其在精巢组织的分化发育、第二性征维持等方面具有重要作用。根据细胞形态及性类固醇激素合成相关酶表达量的变化，精巢间质细胞分化发育可分为4个不同时期，即干细胞期、前体期、未成熟期和成熟期。前两者细胞为纺锤形、数量少、细胞质内无脂滴、内质网少；后两者细胞为圆形、数量较多、增殖活性弱或无、内质网丰富。精巢间质细胞系的建立可为性类固醇激素的合成及其调控相关研究提供一个独特的细胞模型。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种用尼罗罗非鱼精巢组织建立尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的方法，通过该方法可获得在体外能够稳定增殖的尼罗罗非鱼精巢间质细胞，这对于鱼类雄激素产生及其调控相关研究具有重要价值。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种尼罗罗非鱼精巢来源的间质细胞系的建立方法，包括以下步骤：

4、(1)分离和消化尼罗罗非鱼精巢组织；

5、具体操作为：取6月龄尼罗罗非鱼的精巢组织于含有1000units/ml的青霉素、1000μg/ml的链霉素的1×pbs中浸泡10min，然后将其用剪刀剪碎至无明显组织块；向剪碎的尼罗罗非鱼精巢组织中加入0.05％胰酶-edta，于室温下消化1h后，离心收集细胞沉淀；

6、(2)取细胞沉淀，加入培养基获得单细胞悬液，并于0.1％明胶包被的细胞板中培养；

7、所述培养基为含有0.5颗/ml尼罗罗非鱼胚胎提取物、20ng/ml尼罗罗非鱼白血病抑制因子、20ng/ml青鳉胶质细胞源神经营养因子a、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1％虹鳟血清、15％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠、2mm亚硒酸钠、1mm非必需氨基酸、100μmβ-巯基乙醇的高糖dmem培养基；

8、其中，尼罗罗非鱼胚胎提取物的制备方法为：收取出膜前的尼罗罗非鱼胚胎，在冰上研磨，收集研磨物，在液氮中冻融2-4次后继续研磨，将研磨物在12000rpm条件下，4℃离心30min，收集上清，用无菌的去离子水对罗尼罗罗非鱼胚胎提取物进行溶解并定容。

9、虹鳟血清的制备方法为：虹鳟鱼尾静脉抽血，室温静置1-4h后，转移至4℃放置8-12h，然后12000rpm，4℃离心30min，收集上清。

10、(3)根据不同类型精巢细胞贴壁时间不同分离精巢间质细胞，将其转移至新的细胞板中继续培养；由于细胞铺板后24h未贴壁的细胞中含有精巢间质细胞，因此将细胞铺板后24h未贴壁的细胞转移至新的细胞板中继续培养。

11、(4)挑取单克隆并进行传代培养，连续培养40代以上，通过鉴定确定所获得的细胞为尼罗罗非鱼精巢间质细胞系。

12、所述鉴定具体为：

13、a：采用rt-pcr检测第8代克隆化的精巢细胞，其中，精巢间质细胞表达精巢间质细胞的标志分子如sf1、star1，不表达精巢支持细胞(sertoli细胞)标志分子如amh、wt1a以及生殖细胞标志分子如vasa。

14、b：将培养的第15代尼罗罗非鱼精巢间质细胞移植到内源精巢间质细胞消除的尼罗罗非鱼精巢中，步骤包括：

15、(1)通过生殖孔向尼罗罗非鱼精巢中注射二甲磺酸乙烷(ethanedimethanesulphonate，eds)，剂量按75mg/kg计算；

16、(2)按照pkh26红色荧光细胞膜染色试剂盒对分离的尼罗罗非鱼精巢间质细胞进行标记；

17、(3)在eds处理4天后，将pkh26标记的尼罗罗非鱼精巢间质细胞通过生殖孔移植到eds处理的尼罗罗非鱼精巢中；

18、(4)在尼罗罗非鱼间质细胞移植10天后，取受体性腺进行免疫组化染色，尼罗罗非鱼精巢间质细胞表达cyp11b2和3β-hsd。

19、将本发明制备得到的尼罗罗非鱼精巢间质细胞系进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：cctcc no:c2023293；保藏时间为：2023年9月19日；分类命名：尼罗罗非鱼精巢间质细胞系ttl1 oreochromis niloticus。

20、用含有10％dmso、20％胎牛血清的dmso将尼罗罗非鱼精巢间质细胞冻存2个月以上，然后进行复苏，细胞长势良好。

21、本发明具有以下有益效果：

22、本发明建立了一种能够稳定传代和增殖的尼罗罗非鱼精巢间质细胞系，在将其移植到成体间质细胞耗竭的尼罗罗非鱼精巢中，表达cyp11b2和3β-hsd，具有良好的应用前景。

23、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

技术特征：

1.一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(1)具体为：取6月龄尼罗罗非鱼的精巢组织于含有1000units/ml的青霉素、1000μg/ml的链霉素的1×pbs中浸泡10min，然后将其用剪刀剪碎至无明显组织块；向剪碎的尼罗罗非鱼精巢组织中加入0.05％胰酶-edta，于室温下消化1h后，离心收集细胞沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中尼罗罗非鱼胚胎提取物的制备方法为：收取出膜前的尼罗罗非鱼胚胎，在冰上研磨，收集研磨物，在液氮中冻融2-4次后继续研磨，将研磨物在12000rpm条件下，4℃离心30min，收集上清，用无菌的去离子水对罗尼罗罗非鱼胚胎提取物进行溶解并定容。

4.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中虹鳟血清的制备方法为：虹鳟鱼尾静脉抽血，室温静置1-4h后，转移至4℃放置8-12h，然后12000rpm，4℃离心30min，收集上清。

5.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(3)是将细胞铺板后24h未贴壁的细胞转移至新的细胞板中继续培养。

6.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，所述培养是在28℃恒温培养。

7.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法，其特征在于，对传代培养后的细胞进行以下鉴定以确定所得到的细胞为精巢间质细胞：

8.采用权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的尼罗罗非鱼精巢间质细胞系，其特征在于，所述尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的保藏编号为cctcc no:c2023293。

9.采用权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的尼罗罗非鱼精巢间质细胞系在制备治疗鱼类雄激素产生障碍疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明属于水产生物技术领域，涉及一种尼罗罗非鱼精巢间质细胞系的建立方法。包括：(1)分离和消化尼罗罗非鱼精巢组织；(2)取消化后细胞，加入含有20ng/mL青鳉胶质细胞源神经营养因子a的培养基获得单细胞悬液进行培养；(3)细胞铺板24h后，分离未贴壁细胞继续培养；(4)挑取单细胞克隆进行传代培养，RT‑PCR检测细胞不表达vasa、amh、wt1a，表达sf1、star1，且经生殖孔移植可成功定植于尼罗罗非鱼精巢，并表达Cyp11b2和3β‑HSD，对鉴定的精巢间质细胞进行传代培养。本发明获得了在体外能够稳定增殖的尼罗罗非鱼精巢间质细胞系，这对于鱼类雄激素产生及其调控相关研究具有重要价值。

技术研发人员：魏静,李佳能,王德寿
受保护的技术使用者：西部（重庆）科学城种质创制大科学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31