土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺的制作方法

本发明涉及发酵工程，具体涉及一种土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺。

背景技术：

1、β-葡聚糖是由β-1,3-糖苷键连接而成的无分支线性葡聚糖；低聚β-葡聚糖是指β-葡聚糖经过降解得到的低分子量的线性β-1,3-葡聚糖。天然状态下，β-葡聚糖是谷物胚乳和糊粉层细胞壁的一种非淀粉多糖，在不同谷物中含量不等，大麦3％～11％，燕麦3.2％～6.8％，黑麦1％～2％，小麦<1％，可采用提取技术进行规模化生产。然而，受到原料规模、生产周期的限制，通过以上提取方式生产β-葡聚糖的工艺较复杂，且产量较低，远远不能满足市场需求。发酵法也是实现β-葡聚糖规模化生产的可行方法，然而，目前关于低聚β-葡聚糖的发酵工艺研究还有待完善。培养基中各营养元素的种类、含量等都需优化，并且发酵培养基中一般很少添加表面活性剂。而且，传统的酶水解需要将酶进行分离纯化，增加生产周期和生产成本。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，以解决常规发酵工艺有待完善的技术问题。

2、本发明要解决的另一技术问题是，传统的酶水解需要将酶进行分离纯化，增加生产周期和生产成本。

3、为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

4、土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，包括：

5、1)将土壤杆菌菌种接种至土壤杆菌平板培养基，倒置培养；挑取平板上活化后的单菌落接种至土壤杆菌种子培养基，摇瓶培养；然后将种子培养液接种至土壤杆菌发酵培养基，摇瓶培养，得到土壤杆菌种子液；

6、2)将木霉菌种接种至木霉平板培养基培养；然后将孢子悬浮液接种到木霉种子培养基中，摇瓶培养；然后将种子培养液接种到木霉发酵培养基中，摇瓶培养；离心收集菌体，得到木霉菌体；

7、3)将步骤1)所得的土壤杆菌种子液接种于发酵培养基中，待培养基中的氮源耗尽时，接入步骤2)所得的木霉菌体，补加豆芽汁，发酵培养。

8、作为优选，步骤1)包括：将土壤杆菌菌种接种至土壤杆菌平板培养基，30℃倒置培养46h-50h；挑取平板上活化后的单菌落接种至土壤杆菌种子培养基，200rpm、30℃培养14h-18h；然后按照5％v/v接种量，将种子培养液接种至土壤杆菌发酵培养基，200rpm、30℃培养20h-25h，得到土壤杆菌种子液。

9、作为优选，步骤2)包括：木霉在木霉平板培养基上以30℃生长72h；然后以1×108个/ml的接种量将孢子悬浮液接种到木霉种子培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养36h；然后按照5％v/v接种量将种子培养液接种到木霉发酵培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养18h；在4000×g的条件下离心1min收集菌体，得到木霉菌体。

10、作为优选，步骤3)包括：采用50l自动控制发酵罐，将步骤3)所得的土壤杆菌种子液按照5％v/v接种量接种于30l发酵培养基中，温度30℃；细胞生长阶段，溶氧控制在50％，ph7.0；待培养基中的氮源耗尽时，按照10％v/v接种量接入步骤2)所得的木霉菌体，同时补加豆芽汁至终浓度为15％，溶氧控制在60％，ph调节至5.6，发酵时间为144h。

11、作为优选，每l所述土壤杆菌平板培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，琼脂20g；所述土壤杆菌平板培养基的ph为7.0。

12、作为优选，每l所述土壤杆菌种子培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉5g，mgso4 1g，kh2po4 2g；所述土壤杆菌种子培养基的ph为7.0。

13、作为优选，每l所述土壤杆菌发酵培养基含有：葡萄糖60g，酵母粉1g，(nh4)2so42g，mgso4 1g，kh2po4 3g，吐温80 1ml；所述土壤杆菌发酵培养基的ph为7.0。

14、作为优选，每l所述木霉平板培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，琼脂20g；所述木霉平板培养基的ph为6.0。

15、作为优选，每l所述木霉种子培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，(nh4)2so42.5g，kh2po4 6g，mgso4·7h2o 0.8g，cacl2 0.5g；所述木霉种子培养基的ph为6.0。

16、作为优选，每l所述木霉发酵培养基含有：葡萄糖40g，小麦麸皮20g，胰蛋白胨15g，酵母粉0.02g，nano3 5g，kh2po4 10g，吐温80 1ml；所述木霉发酵培养基的初始ph为6.0。

17、本发明公开了一种土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺。该技术方案建立了土壤杆菌和木霉共培养体系。共培养体系分为两阶段：第一阶段土壤杆菌(agrobacterium sp.)进行繁殖产生大量菌体；第二阶段土壤杆菌(agrobacterium sp.)进入产胶期，加入木霉(trichoderma sp.)进行共培养，木霉(trichoderma sp.)产生的β-1,3-葡聚糖酶内切酶将β-葡聚糖降解为低聚β-葡聚糖。本发明所制备的低聚β-葡聚糖，其聚合度可达17-25，共培养体系中β-1,3-葡聚糖酶内切酶最高酶活达到320u/ml，β-葡聚糖最高含量达到45g/l。本发明不仅生产效率高，而且省去了酶的分离纯化环节，缩减了生产周期和生产成本。

技术特征：

1.土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，步骤1)包括：将土壤杆菌菌种接种至土壤杆菌平板培养基，30℃倒置培养46h-50h；挑取平板上活化后的单菌落接种至土壤杆菌种子培养基，200rpm、30℃培养14h-18h；然后按照5％v/v接种量，将种子培养液接种至土壤杆菌发酵培养基，200rpm、30℃培养20h-25h，得到土壤杆菌种子液。

3.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，步骤2)包括：木霉在木霉平板培养基上以30℃生长72h；然后以1×108个/ml的接种量将孢子悬浮液接种到木霉种子培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养36h；然后按照5％v/v接种量将种子培养液接种到木霉发酵培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养18h；在4000×g的条件下离心1min收集菌体，得到木霉菌体。

4.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，步骤3)包括：采用50l自动控制发酵罐，将步骤3)所得的土壤杆菌种子液按照5％v/v接种量接种于30l发酵培养基中，温度30℃；细胞生长阶段，溶氧控制在50％，ph7.0；待培养基中的氮源耗尽时，按照10％v/v接种量接入步骤2)所得的木霉菌体，同时补加豆芽汁至终浓度为15％，溶氧控制在60％，ph调节至5.6，发酵时间为144h。

5.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述土壤杆菌平板培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，琼脂20g；所述土壤杆菌平板培养基的ph为7.0。

6.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述土壤杆菌种子培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉5g，mgso4 1g，kh2po4 2g；所述土壤杆菌种子培养基的ph为7.0。

7.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述土壤杆菌发酵培养基含有：葡萄糖60g，酵母粉1g，(nh4)2so4 2g，mgso41g，kh2po4 3g，吐温80 1ml；所述土壤杆菌发酵培养基的ph为7.0。

8.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述木霉平板培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，琼脂20g；所述木霉平板培养基的ph为6.0。

9.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述木霉种子培养基含有：葡萄糖30g，酵母粉10g，(nh4)2so4 2.5g，kh2po46g，mgso4·7h2o 0.8g，cacl2 0.5g；所述木霉种子培养基的ph为6.0。

10.根据权利要求1所述的土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β-葡聚糖的发酵工艺，其特征在于，每l所述木霉发酵培养基含有：葡萄糖40g，小麦麸皮20g，胰蛋白胨15g，酵母粉0.02g，nano3 5g，kh2po4 10g，吐温80 1ml；所述木霉发酵培养基的初始ph为6.0。

技术总结
本发明公开了一种土壤杆菌联合木霉共培养生产低聚β‑葡聚糖的发酵工艺，属于发酵工程技术领域。该技术方案建立了土壤杆菌和木霉共培养体系。共培养体系分为两阶段：第一阶段土壤杆菌进行繁殖产生大量菌体；第二阶段土壤杆菌进入产胶期，加入木霉进行共培养，木霉产生的β‑1,3‑葡聚糖酶内切酶将β‑葡聚糖降解为低聚β‑葡聚糖。本发明所制备的低聚β‑葡聚糖，其聚合度可达17‑25，共培养体系中β‑1,3‑葡聚糖酶内切酶最高酶活达到320U/mL，β‑葡聚糖最高含量达到45g/L。本发明不仅生产效率高，而且省去了酶的分离纯化环节，缩减了生产周期和生产成本。

技术研发人员：魏哲,吕厚臣,陈鑫鑫,秦配玲,夏瑶瑶,崔新冉
受保护的技术使用者：山东金洋药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27