靶向hTUBB8基因的供体片段、卵子成熟障碍动物模型的构建方法及其应用与流程

本申请涉及动物模型，特别是涉及一种靶向htubb8基因的供体片段、卵子细胞成熟障碍动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、近年来，不孕不育成为影响人类生理和心理健康的重大疾病之一，全球约15％的夫妇受其困扰，其中女性不孕为主要因素。卵母细胞成熟经历恢复减数分裂、生殖泡消失、排出极体等一系列复杂的生理变化与分子调节等过程，方能获得受精并发育成新个体的潜能。当卵母细胞因各种原因导致卵细胞成熟过程发生异常时，卵母细胞无法成熟，无法完成受精过程，从而导致不孕。临床上，反复完全性卵母细胞成熟障碍并不少见。其主要类型是患者在不同ivf/icsi周期的大部分卵母细胞反复发生成熟阻滞而导致原发性不孕，这是少数女性多次接受辅助生殖技术助孕仍失败的原因之一。随着二代测序技术的广泛应用，多个导致人卵发育成熟障碍的致病基因被发现。然而目前在临床上，卵子成熟障碍尚无可有效治疗的方法，许多女性不孕患者的致病机制尚不明确。

2、因此，寻找新的致病基因和新的动物模型对于临床诊断和治疗卵子成熟障碍导致女性不孕的相关疾病具有重要意义。

技术实现思路

1、本申请研究发现，tubb8(c.g785a)突变具有显性负性效应，可破坏微管的功能以及卵母细胞减数分裂纺锤体的组装，从而导致女性不孕。基于此，本申请设计了简单有效的方式，利用crispr-cas系统快速敲入htubb8基因，构建该疾病的动物模型。本申请利用zp3启动子驱动tubb8(c.g785a)基因的表达，crispr-cas系统能够在grna的指引下在精准切割dna造成双链断裂，能够特异性地敲入htubb8(c.g785a)基因突变，从而构建得到雌性不孕的动物模型。

2、本申请的具体方案如下：

3、本申请的第一方面提供了一种靶向htubb8基因的供体片段，所述供体片段从5’端至3’端依次为zp3启动子区域、kozak序列、突变的htubb8基因片段、标签序列、wpre序列和终止子序列，其中突变的htubb8基因片段，其与野生型htubb8基因相比具有以下突变：c.785g>a，所述野生型htubb8基因的cdna序列如seq id no：3所示。

4、在其中一个实施例中，所述供体片段的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、一种htubb8基因编辑系统，所述编辑系统包括上述靶向htubb8基因的供体片段；

6、可选地，所述编辑系统还包括cas9核酸酶、cas9mrna和grna中的一种或多种。

7、一种重组细胞，所述重组细胞包括上述的靶向htubb8基因的供体片段或上述的htubb8基因编辑系统。

8、本申请还提供一种卵子成熟障碍动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

9、用上述的htubb8基因编辑系统构建卵子成熟障碍动物模型。

10、在其中一个实施例中，所述构建方法包括如下步骤：

11、将所述htubb8基因编辑系统转入目标动物的受精卵内；

12、将转入所述htubb8基因编辑系统的受精卵移植到雌性动物体内并产出f0代；以及

13、将所述f0代与野生型进行交配，获得f1代杂合子，将f1代杂合子进行自交，筛选出纯合的f2代作为卵子成熟障碍动物模型。

14、在其中一个实施例中，所述转入的方法包括显微注射。

15、在其中一个实施例中，所述构建方法还包括如下步骤：

16、使用核苷酸序列如seq id no:4～7所示的引物对鉴定目标动物的htubb8基因型。

17、在其中一个实施例中，鉴定的方法包括pcr和sanger测序中的一种或多种。

18、本申请利用zp3启动子驱动tubb8(c.g785a)基因的表达，进而模拟了tubb8突变患者的表达特征。本申请提供一种htubb8(c.g785a)基因敲入小鼠模型的构建方法，利用crispr-cas系统在grna的指引下在精准切割dna造成双链断裂，能够特异性地敲入htubb8(c.g785a)基因突变，精准模拟了tubb8突变患者的突变位点。由此构建出了有效的能够模拟患者所携带的tubb8表达特征和突变位点的小鼠模型，对于深入分析该突变的致病性及探究治疗策略提供帮助，为临床上该类基因缺陷患者的诊断和治疗提供新的参考。

19、本申请还提供一种筛选或鉴定用于治疗卵子成熟障碍的药物的方法，使用如上述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法制得的卵子成熟障碍动物模型，筛选或鉴定用于治疗卵子成熟障碍的药物。

技术特征：

1.一种靶向htubb8基因的供体片段，其特征在于，所述供体片段从5’端至3’端依次为zp3启动子区域、kozak序列、突变的htubb8基因片段、标签序列、wpre序列和终止子序列，其中突变的htubb8基因片段，其与野生型htubb8基因相比具有以下突变：c.785g>a，所述野生型htubb8基因的cdna序列如seq id no：3所示。

2.根据权利要求1所述的靶向htubb8基因的供体片段，其特征在于，所述供体片段的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.一种htubb8基因编辑系统，其特征在于，所述编辑系统包括权利要求1所述的靶向htubb8基因的供体片段；

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求1～2任一项所述的靶向htubb8基因的供体片段或权利要求3所述的htubb8基因编辑系统。

5.一种卵子成熟障碍动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法，其特征在于，所述转入的方法包括显微注射。

8.根据权利要求6～7任一项所述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法，其特征在于，鉴定的方法包括pcr和sanger测序中的一种或多种。

10.一种筛选或鉴定用于治疗卵子成熟障碍的药物的方法，其特征在于，使用如权利要求5～9任一项所述的卵子成熟障碍动物模型的构建方法制得的卵子成熟障碍动物模型，筛选或鉴定用于治疗卵子成熟障碍的药物。

技术总结
本申请提供了一种靶向突变hTUBB8基因的供体片段、卵子成熟障碍动物模型的构建方法及其应用。该所述供体片段从5’端至3’端依次为ZP3启动子区域、Kozak序列、突变的hTUBB8基因片段、标签序列、WPRE序列和终止子序列，其中突变的hTUBB8基因片段，其与野生型hTUBB8基因相比具有以下突变：c.785G>A，所述野生型hTUBB8基因的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示。采用本申请的核酸产品构建得到的动物模型能对深入分析TUBB8突变的致病性，及探究治疗策略提供帮助，为临床上该类基因缺陷患者的诊断和治疗提供新的参考。

技术研发人员：张天镭,郑伟,谷峰,李卓,彭梓妍,林戈
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31