一种创伤弧菌噬菌体13VV501A、微生态制剂及其应用的制作方法

本申请涉及水产防治的，更具体地说，涉及一种创伤弧菌噬菌体13vv501a、微生态制剂及其应用。

背景技术：

1、创伤弧菌(vibrio vulnificus)属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性、嗜盐、氧化酶阳性、兼性厌氧、有荚膜、不产芽孢、有动力的弧菌。创伤弧菌自然生存于河海交界之处，广泛存在于亚热带海洋环境及海产品中，当海水温度持续2周以上超过20℃时，创伤弧菌会大量繁殖，易感染各种水产动物，如鱼、虾、蟹、牡蛎、蛤、蚶及螺等，是水产养殖中重要的细菌性病原之一，是引起人兽共患病的病原菌。食用受创伤弧菌污染的海产品或水源，或是创口接触了带创伤弧菌的海水或海洋动物，都有可能感染上创伤弧菌。受该菌感染后的临床表现主要有原发性败血症、伤口感染及急性胃肠炎三大症状，败血症和伤口感染都以宿主组织中细菌极快复制和皮肤组织广泛损伤而闻名，即使进行了治疗，败血症的死亡率也可高达75％，伤口感染的死亡率可高达50％。不仅严重威胁人类的饮食健康，也给水产养殖业造成巨大的经济损失。

2、目前，对创伤弧菌的防治主要依赖于抗生素和一些化学药物。随着人们环保意识的提高以及可持续农业发展战略的实施，寻找环保、安全、有效的生物防治措施越来越被人们重视。

3、水产噬菌体微生态制剂具有环境友好、对非靶标生物安全以及对水产病害具有特异性杀菌效果等优点，不同于抗生素和化学制剂，是完全源于自然的绿色环保产品，广泛应用于水产养殖领域和食品安全领域，在养殖业中替代抗生素用于防病抗病、克服过量使用抗生素带来的致病菌耐药性问题，已成为当前生物技术研究的热点。

4、然而，抗生素等化学制剂对水产病害的防治效果差，药效短，见效差，且容易导致病原耐药性增强。同时，噬菌体对宿主有高度专一性，一般只能裂解一种宿主，因此窄谱噬菌体一般不能解决在水产养殖过程中出现的多种弧菌病害感染问题。

5、因此，需要寻找新的方法来解决在水产养殖过程中出现的多种弧菌病害感染问题。

技术实现思路

1、本申请提供一种创伤弧菌噬菌体13vv501a、微生态制剂及其应用。本申请的噬菌体噬菌谱广，能同时裂解7种不同的宿主，能裂解21株创伤弧菌、14株副溶血弧菌、11株哈维氏弧菌。能更有效的解决水产养殖中出现的多种弧菌病害感染问题，具有良好的应用前景。

2、第一方面，本申请提供一种创伤弧菌噬菌体13vv501a，采用如下技术方案：

3、一种创伤弧菌噬菌体13vv501a，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a(vibriovulnificus phage 13vv501a)于2023年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2023393，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

4、本申请的噬菌体噬菌谱广，能同时裂解7种不同的宿主，能裂解21株创伤弧菌、14株副溶血弧菌、11株哈维氏弧菌。能更有效的解决水产养殖中出现的多种弧菌病害感染问题，具有良好的应用前景。

5、可选地，所述噬菌体是有尾噬菌体纲caudoviricetes的噬菌体新种。

6、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a包括2个特异性基因片段，分别为特异性基因片段v1和特异性基因片段v2。

7、可选地，所述特异性基因片段v1包括如seq id no.1所示的核苷酸序列；

8、可选地，所述特异性基因片段v2包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。

9、通过这两个特异性基因片段可以作为识别该噬菌体的典型特征。

10、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a在70℃的条件下能够存活。

11、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a在ph值为4和10的条件下能够存活。

12、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a在紫外照射8h的条件下能够存活。

13、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a对创伤弧菌的最佳感染复数为0.01。

14、第二方面，本申请提供一种引物，采用如下技术方案：

15、一种引物，所述引物用于特异性扩增上述特异性基因片段v1；所述引物为如seqid no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列。

16、第三方面，本申请提供一种引物，采用如下技术方案：

17、一种引物，所述引物用于特异性扩增上述特异性基因片段v2；所述引物为如seqid no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列。

18、通过这两个特异性pcr扩增引物可作为识别该噬菌体的典型特征。

19、第四方面，本申请提供一种微生态制剂，采用如下技术方案：

20、一种微生态制剂，所述微生态制剂包括上述创伤弧菌噬菌体13vv501a。

21、可选地，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a的有效价为8.2×1011pfu/ml。

22、本申请的微生态制剂可用于预防和防治水产创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌等弧菌病害。

23、第五方面，本申请提供一种上述创伤弧菌噬菌体13vv501a、上述微生态制剂在预防和防治水产动物弧菌病害方面的应用。

24、可选地，所述弧菌包括创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌、霍乱弧菌、欧文斯氏弧菌。

25、综上所述，本申请具有以下有益效果：

26、本申请的创伤弧菌噬菌体13vv501a噬菌谱广，能同时裂解7种不同的宿主，能裂解21株创伤弧菌、14株副溶血弧菌、11株哈维氏弧菌、7株溶藻弧菌、6株坎氏弧菌、4株霍乱弧菌、3株欧文斯氏弧菌，能更有效地解决水产养殖中出现的多种弧菌病害感染问题。同时，噬菌体离开宿主微生物后无法独立生长和繁殖，也无法侵染其他生物和人类，不产生生物危害和环境污染。因此，本申请分离筛选新的具有高裂解能力的噬菌体用于抑菌杀菌不仅有效，而且具有高度的安全性，在水产动物弧菌病害预防和防治上具有重大意义。

技术特征：

1. 一种创伤弧菌噬菌体13vv501a（vibrio vulnificus phage 13vv501a），其特征在于，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2023393。

2.根据权利要求1所述的创伤弧菌噬菌体13vv501a，其特征在于，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a包括2个特异性基因片段，分别为特异性基因片段v1和特异性基因片段v2；

3.根据权利要求1所述的创伤弧菌噬菌体13vv501a，其特征在于，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a在70℃的条件下能够存活；

4.根据权利要求1所述的创伤弧菌噬菌体13vv501a，其特征在于，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a对创伤弧菌的最佳感染复数为0.01。

5. 一种引物，其特征在于，所述引物用于特异性扩增权利要求2所述的特异性基因片段v1；所述引物为如seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列。

6. 一种引物，其特征在于，所述引物用于特异性扩增权利要求2所述的特异性基因片段v2；所述引物为如seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列。

7.一种微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂包括权利要求1-4中任一项所述的创伤弧菌噬菌体13vv501a。

8.根据权利要求8所述的微生态制剂，其特征在于，所述创伤弧菌噬菌体13vv501a的有效价为8.2×1011pfu/ml。

9.一种权利要求1-4中任一项所述的创伤弧菌噬菌体13vv501a、权利要求7-8中任一项所述的微生态制剂在预防和防治水产动物弧菌病害方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述弧菌包括创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌、霍乱弧菌、欧文斯氏弧菌。

技术总结
本申请涉及水产防治的技术领域，具体公开了一种创伤弧菌噬菌体13VV501A、微生态制剂及其应用。该创伤弧菌噬菌体13VV501A（Vibrio vulnificus phage 13VV501A）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023393。本申请的创伤弧菌噬菌体13VV501A噬菌谱广，能同时裂解7种不同的宿主，能裂解21株创伤弧菌、14株副溶血弧菌、11株哈维氏弧菌、7株溶藻弧菌、6株坎氏弧菌、4株霍乱弧菌、3株欧文斯氏弧菌，能更有效地解决水产养殖中出现的多种弧菌病害感染问题。

技术研发人员：陈德国,林茂,邵琦,蒋诗涛,赖阳琼,靳婷,韦信贤,童桂香
受保护的技术使用者：厦门昶科生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31