一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤FH和MED12基因突变的文库构建方法与流程

本发明属于生物，尤其涉及一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变的文库构建方法。

背景技术：

1、子宫平滑肌瘤是女性生殖系统中最常见的良性肿瘤，主要的基因变异包括med12突变，hmga2、hmga1重排，col4a5、col4a6缺失，fh突变。其中，fh基因编码延胡索酸水合酶(fumarate hydratase)，位于染色体1q42.3-q43，大小约22kb，含有10个外显子，基因产物为fh，是三羧酸循环中催化延胡索酸+h2o--苹果酸反应的关键酶。fh基因胚系突变引起遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌综合征(hlrcc)，是一种常染色体显性综合征，以子宫、皮肤平滑肌瘤和肾细胞癌(rcc)为特征。fh基因突变引起双等位基因失活导致fh活性完全丧失或降低，造成细胞内延胡索酸积累，糖酵解加强，引起不依赖低氧环境的低氧诱导因子1α(hif-1α)稳定表达，细胞内微环境改变，从而有利于肿瘤发生。

2、fh缺陷型平滑肌瘤基因突变类型包括体系突变和胚系突变两种，研究表明fh基因的体系突变较胚系突变更常见，fh基因的体系突变与hlrcc无关。fh免疫组化不能代替基因检测，仅利用fh的免疫组化对hlrcc患者进行筛选会造成漏诊。基因检测才是诊断fh缺陷型子宫平滑肌瘤的金标准。

3、根据文献报道，子宫平滑肌瘤形成的分子机制中，绝大多数fh缺陷型患者是由于fh基因杂合性缺失(loh)导致双等位基因fh失活，体细胞med12突变和基因拷贝数缺失。而对于散发性子宫平滑肌瘤最常见的是med12基因突变引起。纳入med12基因的检测有助于辅助遗传性平滑肌瘤病及肾细胞癌(hlrcc)综合征筛查。

4、目前，针对于fh基因检测临床主要采用一代测序，由于fh基因无明确的热点突变，一代测序检测需要覆盖fh基因10个外显子，需要10对扩增引物进行10个pcr反应和10个测序反应，实验操作繁琐，成本高，而且未纳入med12基因的检测。

技术实现思路

1、鉴于fh重要的临床意义和子宫平滑肌瘤的分子机制，本发明提供一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变的文库构建方法，可实现单管pcr建库完成fh和med12基因突变检测，同时，引入内参序列扩增(ref_gene-1～ref_gene-14)，实现fh基因拷贝数的检测，具有操作简单、样本投入量少等优势。本发明提供的建库方法可用于定性检测子宫肌瘤组织样本/外周血样本中的fh基因和med12突变，辅助遗传性平滑肌瘤病及肾细胞癌(hlrcc)综合征筛查。

2、本发明的文库构建方法的原理是基于多重pcr的扩增子靶向测序，先使用针对目标区域的特异修饰性扩增引物(gsp)对dna模板的靶序列进行精准pcr扩增富集，再使用一对带有测序接头序列的接头扩增引物，用于对富集产物进行扩增并加上测序接头，通过两步pcr完成测序文库的构建。

3、本发明结合优化的pcr反应程序和高特异ringcap-taq酶的使用，在普通pcr平台上实现对样品核酸中目标序列进行用于高通量测序使用的文库构建，以实现对多基因多靶点突变进行准确、快速检测。

4、本发明设计及应用所用的引物序列如下表1所示：

5、表1

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9、其中，ill-ixx-p5和ill-ixx-p7序列中的“nnnnnnn”为index，可根据所用index序列进行替换，并将引物名称修改为相应编号，如ll-i01-p5和ill-i01-p7。

10、为了实现单管pcr建库检测fh和med12基因突变，现提供一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变的文库构建方法：

11、1.使用优化好的pcr富集反应液(参照表2和表3)，以dna样本为模板根据表4程序扩增目标基因序列，得到pcr产物。

12、表2.pcr富集反应液基础配方

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15、表3.引物mix配方

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18、表4.富集反应扩增程序

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20、2.磁珠纯化pcr产物，得到富集产物。

21、3.使用带有测序接头序列和标签序列(index)接头扩增引物配制序接头连接反应液(配方见表5)对富集产物，按照表6程序进行二轮扩增。

22、表5.测序接头连接反应液配方

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24、表6.接头连接反应扩增程序

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26、4.扩增产物采用磁珠纯化后，得到样本的文库。

27、5.将文库用于下一步高通量测序仪器进行检测，得到目标序列信息，即fastq文件。

28、6.fastq文件经生物信息学分析处理，进行数据质控、序列比对、突变注释和拷贝数分析。其中，拷贝数分析的原理为计算fh基因各个外显子的覆盖深度占比和对应外显子基线占比的比值cnv-ratio，若cnv-ratio≤0.8，则判定为该外显子发生拷贝数缺失；若cnv-ratio≥1.2，则判定为该外显子未发生拷贝数缺失；若0.8<cnv-ratio<1.2，则提示该外显子可能存在拷贝数缺失。

29、上述基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变的文库构建方法，包括引物设计和实验流程的优化。文库仅以illumina平台接头为例，也根据引物设计思路，更换不同的测序接头序列，以实现兼容不同测序平台，包括华大智造，ion torrent等。

30、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

31、1)整合了fh突变和med12突变的检测，由于两个基因在子宫平滑肌瘤的形成机制上是互斥的，med12突变的检测结果能进一步的辅助遗传性平滑肌瘤病及肾细胞癌(hlrcc)综合征筛查；2)通过引物设计实现了单管pcr建库完成fh和med12基因突变检测，相较于需要10管pcr扩增和10次测序反应的一代测序检测，具有操作简单、样本投入量少等优势；3)通过引入内参序列扩增，和基线样本分析，实现fh基因拷贝数的检测；4)所有引物对扩增长度均控制在200bp以内，适用于血液样本或一定程度降解的石蜡样本来源的dna建库。本发明解决了现行一代测序检测fh突变的不足，更适合于临床检测。

技术特征：

1.一种基于高通量测序构建子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变文库的多重pcr引物，其特征在于，所述pcr引物序列如seq id no.1-82所示。

2.一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变的文库构建方法，其特征在于，所述文库构建方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中多重pcr反应的体系如下表所示：

4.根据权利要求3所述的文库构建方法，其特征在于，所述引物mix的具体组成如下表所示：

5.根据权利要求4所述的文库构建方法，其特征在于，所述多重pcr反应的程序如下表所示：

6.根据权利要求1-5中任一项所述的文库构建方法，其特征在于，所述待测样品为ffpe样本、新鲜组织或外周血基因组dna。

7.权利要求1-5中任一项所述的文库构建方法构建得到的文库。

8.权利要求6所述的文库构建方法构建得到的文库。

9.权利要求1所述的多重pcr引物在构建子宫平滑肌瘤fh和med12基因突变文库中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于高通量测序检测子宫平滑肌瘤FH和MED12基因突变的文库构建方法，属于生物技术领域。本发明基于多重PCR的扩增子靶向测序，先使用针对目标区域的特异修饰性扩增引物SEQ ID NO.1‑82(GSP)对DNA模板的靶序列进行精准PCR扩增富集，再使用一对带有测序接头序列的接头扩增引物SEQ ID NO.83‑84，对富集产物进行扩增并加上测序接头，通过两步PCR完成测序文库的构建。本发明提供的建库方法可用于定性检测子宫肌瘤组织样本/外周血样本中的FH基因和MED12突变，辅助遗传性平滑肌瘤病及肾细胞癌(HLRCC)综合征筛查。

技术研发人员：陈志宏,钟镇涛,郑甜,吴志煌,陈琰
受保护的技术使用者：厦门飞朔生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5