次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成5-磷酸核糖的方法和应用

本发明属于生物酶工程，具体涉及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成5-磷酸核糖的方法和应用，是一种以次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶为催化剂，在水解单磷酸肌苷，获得d-核糖-5-磷酸方向上的应用。

背景技术：

1、d-核糖-5-磷酸(ribose 5-phosphate,r5p)是核酸和核苷酸的组成成分，是嘌呤核苷酸合成的原料。在生物代谢过程中，r5p既可由磷酸戊糖途径生成，也可通过糖分解代谢的中间产物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛经基团转移反应的逆反应生成，但在人体主要是经前一过程生成。肌组织缺乏6-磷酸葡萄糖脱氢酶，磷酸核糖则靠基团转移反应生成。r5p是核糖磷酸途径中的中间产物，与糖代谢和能量产生密切相关。此外，r5p还参与合成多种辅酶，如辅酶a、辅酶q等。r5p与nadph(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)一起参与抗氧化还原平衡，维持细胞内的氧化还原环境。在细胞信号传导过程中，r5p通过参与多种代谢途径，如ppp(糖异生途径)、核糖醇磷酸途径等，间接参与调节细胞信号传导网络，影响细胞的生长、分化和存活。基于r5p重要的生理学意义，r5p的合成在核酸药物生产、辅酶和生化产品合成过程中是至关重要的一环。目前r5p制备方法是通过生物提取或化学合成途径制备，但收率极低，无法大规模制备，导致r5p价格十分昂贵。与化学合成比较，生物酶法合成r5p具有高效环保的优势，无有机溶剂残留且不存在手性问题。核糖激酶可催化r5p合成，但无相关工业应用报道，且受其底物atp价格较高、酶分子量较大等因素的限制，可用于合成r5p的新型高效生物催化剂仍亟待开发。

2、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,hgprt)，属于6-氧代嘌呤磷酸核糖基转移酶(prtase)家族，目前报道的生物学功能为催化鸟嘌呤/次黄嘌呤与5-磷酸核糖-1-焦磷酸(prpp)缩合生成鸟嘌呤/次黄嘌呤核苷单磷酸(gmp/imp)，是鸟嘌呤和次黄嘌呤补救合成途径关键酶。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成5-磷酸核糖的方法，一种可用于合成d-核糖-5-磷酸(r5p)的新型生物催化剂，是一种应用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶水解单磷酸肌苷(inosine monophosphate,imp)，获得d-核糖-5-磷酸的方法。该方法具有酶催化剂易制备、可操作性强、反应步骤简单、底物单一、转化效率高、无需辅因子等优势。

2、本发明提供的一种应用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成r5p的方法，以imp为底物，经酶催化体系催化获得r5p，所述酶催化体系由次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶组成。

3、具体步骤为：以imp为原料，通过酶催化体系中的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下，水解获得r5p和次黄嘌呤(hx)，反应式如下：

4、

5、本发明所述所述酶催化体系包括次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶与底物单磷酸肌苷，生物催化剂为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。所述酶催化体系中次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶纯化后为游离纯酶。向该酶反应体系加入imp，在控制ph和温度的条件下，imp被水解为r5p。

6、所述次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的添加量为0.1～5.0mg/ml。酶催化体系中，底物单磷酸肌苷的添加量为0.5-30mm。反应温度为25-37℃，反应时间为2-20h，控制反应的ph值为6～9。

7、具体的，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶来源于结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，编码该次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的核苷酸序列来源于genbank，编号为u88876.1，经密码子优化后，如序列表中mthgprt-dna(seq.no.1)所示。

8、具体的，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如序列表中mthgprt-aa(seq.no.2)所示。

9、如本领域技术人员所知，本发明的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中mthgprt-aa(seq.no.2)所示的氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。

10、任何对mthgprt-dna所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、确实或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

11、任何对mthgprt-aa所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有r5p生成活性的，仍属于本发明的保护范围。

12、对于次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，任何其他来源的同工酶具有r5p生成活性的，均属于本发明的保护范围。

13、作为优选，催化体系中，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的添加量为0.1-5.0mg/ml。

14、催化体系中，底物imp的添加量为0.5-30mm。

15、作为优选，酶催化体系中，反应温度为25-37℃，反应时间为2-20h；更优选，温度为30～37℃，时间为4-14h。

16、作为优选，控制反应的ph值为6～9，采用氢氧化钠来控制ph的下降，采用甲酸来控制ph的上升。

17、本发明的另一个目的是提供所述方法在合成d-核糖-5-磷酸中的应用。

18、本发明的有益效果主要体现在：提供了一种以次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作为生物催化剂通过催化imp水解获得r5p的方法，目前尚未见报道；本发明中所述的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶分子量小，易纯化，大肠杆菌异源表达量可达到10mg/升培养基，可用镍亲和层析一步纯化获得纯度95％以上的游离酶，同时在ph值接近中性、常温下进行反应，无需过渡金属及有机溶剂参与反应，无需金属离子作为辅因子，因此具有催化反应速率高、异源表达量高、易于纯化等特点，同时也具备反应条件温和、环境友好等生物催化的优势，具有良好的工业化应用开发前景。

技术特征：

1.一种次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成5-磷酸核糖的方法，其特征在于，以单磷酸肌苷为底物，经酶催化体系催化获得d-核糖-5-磷酸，所述酶催化体系由次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：以单磷酸肌苷为原料，在酶催化体系中的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的催化下，将底物水解得到d-核糖-5-磷酸，反应式：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶来源于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)，编码次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如seq.no.1所示，其氨基酸序列如seq.no.2所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系包括次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶与底物单磷酸肌苷，所述酶催化体系中次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶经纯化后为游离纯酶。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，酶催化体系中，所述次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的添加量为0.1～5.0mg/ml。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，酶催化体系中，底物单磷酸肌苷的添加量为0.5-30mm。反应温度为25-37℃，反应时间为2-20h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，控制反应的ph值为6～9。

8.权利要求1所述方法在合成d-核糖-5-磷酸中的应用。

技术总结
本发明提供次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶合成5‑磷酸核糖的方法和应用。以单磷酸肌苷为底物，经次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶催化体系将其水解生成D‑核糖‑5‑磷酸，是一种以次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶为催化剂，在水解单磷酸肌苷获得D‑核糖‑5‑磷酸方向上的应用。所述催化体系由次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶组成。本发明中所述应用次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶作为催化剂合成D‑核糖‑5‑磷酸的方法，具有反应步骤简单、反应条件温和、催化速率高、环境友好、酶表达纯化简单、酶工程操作性强等优点，在D‑核糖‑5‑磷酸及其相关产品的工业合成领域具有良好的应用开发前景。

技术研发人员：孙莲莉,刘洋,林翠颖,范宇哲
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27