用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物与流程

背景技术

0、
背景技术：

1、可以为了多种应用将核酸固定化在固体载体上，所述应用包括在载体上的化学或酶促核酸合成、测序反应、用于纯化物质的亲和色谱法、或用在体外诊断中以鉴别和定量非常少量的靶标的杂交测定。固定化的核酸经常被用于从复杂混合物或生物样品特异性地分离靶配体，其中将核酸设计成与期望的靶分子选择性地杂交。

2、适合用于固定化核酸的不同类型的材料是本领域已知的，包括尼龙、硝化纤维素、活化的琼脂糖、重氮化的纤维素、胶乳颗粒、塑料、聚苯乙烯、玻璃和聚合物包被的表面。这些材料以许多形式使用，诸如膜、平板、载玻片、芯片、树脂、珠、探针、微量滴定板、浸渍棒等。多种化学修饰可用于核酸与这些载体(它们经常被称作(固体)载体)的共价偶联(直接地或通过接头)。为了允许核酸分子的结合，典型地将载体官能化以暴露亲核基团，其与核酸上的反应性基团反应。可替换地，将反应性基团引入载体以与存在于核酸中的亲核体反应。合适的基团或部分包括羟基、巯基、氨基和活化的羧酸基团，而能够与这些反应的基团包括二氯三嗪基、烷基环氧基、马来酰亚胺基、溴乙酰基和其它。用于将核酸偶联至不同类型的官能化的固体载体的策略描述在例如gosh和musso(nuc.acid res.,15(13),5353-5372,1987)或devor等人(“strategies for attaching oligonucleotides to solidsupports”,integrated dna technologies,2005)。取决于反应性基团或亲核基团在固体载体和核酸分子上的存在，可以直接执行偶联或用双官能试剂或交联剂执行偶联。双官能试剂和偶联剂是本领域众所周知的且可从商业来源诸如thermo fisher scientific、sigma-aldrich、proteochem等得到。

3、一种广泛使用的用于将核酸附接至固体载体的表面化学类型是羧酸官能团。具有羧酸官能团的表面通常可以如下提供：用带有这样的羧酸基团的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物处理未包被的表面(例如未包被的聚合物颗粒)。例如，与甲基丙烯酸的溶液共聚得到带有末端羧基的聚合物涂层。为了允许与羧酸包被的表面的共价偶联，典型地用官能性反应性基团修饰核酸。例如，可以在它的5’或3’末端给核酸提供伯氨基以允许胺化的分子与活化的羧酸酯表面的偶联(例如使用碳二亚胺化学)，这产生共价的羰基酰胺键。可替换地，可以将核酸以巯基修饰形式提供并可以经由烷基化剂共价地连接至马来酰亚胺修饰的表面。

4、许多应用需要非常有效的偶联方法以允许核酸向给定的载体上的定量负载，这会促进偶联产率的可预测性并因而促进偶联反应的可靠性。但是，当在水性缓冲液中使用标准程序将胺化的核酸偶联至羧酸官能化的载体时(例如通过使用碳二亚胺化学以活化羧酸基团)，通过本领域已知的方法实现的偶联效率是有限的。经常通过提供增加的量的核酸以得到固定化的核酸的足够产率来补偿低偶联效率。标准偶联程序的另一个经常观察到的缺点是经由核酸的内部仲胺基团的非特异性偶联事件的高发率或固定化的寡核苷酸的不利杂交动力学，它们二者可能导致在不同测定中的高背景。

5、因而，普遍希望开发具有提高的偶联效率的方法，其导致表面结合的核酸的高且可预测的产率，而不需要增加向偶联反应中加入的核酸分子的量。

6、因此，本发明的一个目的是，提供允许以较高效率将核酸偶联至固体载体的组合物和方法。本发明的另一个目的是，提供这样的组合物和方法：其减少达到期望的偶联产率所需的核酸的量。本发明的另一个目的是，提供这样的组合物和方法：其减少核酸分子与固体载体的非特异性偶联。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、用于将核酸偶联在羧酸酯官能化的载体上的现有技术程序具有低偶联效率，且需要不实际的量的核酸才能达到适当水平的偶联产率。发明人已经令人惊讶地发现，当在有机相中进行活化和偶联反应时(即在有机溶剂存在下)，可以有效地提高偶联效率，由此同时减少非特异性偶联。

2、因此，本发明部分地涉及用于将核酸偶联至固体载体的方法和组合物。具体地，本发明寻求提高胺化的核酸分子与被羧酸基团官能化的固体表面的偶联效率。已经认识到，通过在有机溶剂存在下进行活化和偶联反应两者，可以实现这些目的。已经进一步认识到，通过向偶联反应中添加盐，可以进一步减少非特异性偶联。

3、因此，本发明的第一方面提供了一种用于将核酸分子偶联至载体的方法，所述方法包括：(a)提供载体，所述载体在其上包含羧酸基团，(b)提供核酸，其中所述核酸包含至少一个伯胺官能团，(c)通过使在载体上的羧酸基团与碳二亚胺或其衍生物接触以形成反应性酸酐来活化所述载体，(d)使所述反应性酸酐与所述核酸的至少一个伯胺官能团反应以形成共价酰胺键，由此将所述核酸偶联至所述载体，其中在有机溶剂存在下进行步骤(c)和(d)。在某些实施方案中，在盐存在下进行步骤(c)和(d)。根据第一方面的一种方法可以进一步包括(e)分离步骤(d)的偶联溶液和所述载体以及洗涤所述载体。

4、本发明的第二方面提供了一种用于将核酸偶联至官能化的载体的组合物。在第一个实施方案中，所述组合物包含在其上包含羧酸基团的载体、包含至少一个伯胺官能团的核酸、碳二亚胺或其衍生物和有机溶剂。在第二个实施方案中，所述组合物包含在其上包含羧酸基团的载体、有机溶剂和任选的异脲副产物，其中至少所述羧酸基团的第一部分被反应性酸酐修饰且至少所述羧酸基团的第二部分经由羰基-酰胺键键合至核酸。在第三个实施方案中，所述组合物包含载体和有机溶剂，所述载体在其上包含经由羰基-酰胺键键合至核酸的羧酸基团，其中所述载体是具有约10至约10,000pmol/mg载体之间或约50至约5,000pmol/mg载体之间的核酸偶联密度的珠。

5、本发明的第三方面提供了一种用于将核酸偶联至固体载体的试剂盒，所述试剂盒包含在其上包含羧酸基团的载体、有机溶剂、碳二亚胺或其衍生物、和任选的核酸。

6、本发明的方法、组合物和试剂盒不限于刚刚提及的主题，而是，非限制性地在以下说明书和权利要求中更充分地描述。

7、特别在所附权利要求中阐述了本发明的新颖特征。参考以下阐述示例性实施方案的详细描述(其中利用了本发明的原理)和附图将更好地理解本发明的特征和优点。

技术特征：

1.一种用于将核酸偶联至载体的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中在盐存在下进行步骤(c)和(d)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述盐是无机盐。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述盐是licl或nacl。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述盐以至少约0.1m且小于约1.0m或至少约0.2m且小于约0.8m的浓度存在于步骤(c)和/或(d)中。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，将所述盐溶解在有机溶剂中。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二乙基亚砜或其混合物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂以每总体积至少约50％且小于95％的浓度存在于步骤(c)和/或步骤(d)中。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在有水或水性缓冲液存在下进行步骤(c)和/或步骤(d)，其中所述水或水性缓冲液的浓度是每总体积小于20％，优选地小于10％。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳二亚胺是edc。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，将所述碳二亚胺或其衍生物溶解在水性缓冲液中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水性缓冲液是mes或咪唑缓冲液。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述水性缓冲液包含在约5.0和约7.0之间的ph。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在约4.5和约7.0之间的ph执行步骤(c)和/或(d)。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，在有机溶剂中提供所述载体。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(d)中之前，在有机溶剂中提供所述核酸。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中活化所述载体之前，将所述核酸与所述载体组合。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中活化所述载体之后，将所述核酸与所述载体组合。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约10和约10,000pmol/mg载体之间或约50和约5,000pmol/mg载体之间的浓度提供所述核酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在室温执行步骤(c)和(d)。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将步骤(d)执行至少3小时，优选地至少10小时。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，将所述载体上至少0.1％的羧酸基团键合至核酸分子。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括(e)将步骤(d)的偶联溶液和所述载体分离并且洗涤所述载体，任选地其中用水性溶液或水执行所述洗涤。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括(f)使所述载体与naoh溶液接触和/或加热所述载体。

25.一种组合物，其包含：

26.一种组合物，其包含：

27.根据权利要求26所述的组合物，进一步包含：

28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中经由羰基-酰胺键键合至核酸的载体上的羧酸基团的百分比是至少0.1％，优选地至少0.2％。

29.一种用于将核酸偶联至固体载体的试剂盒，包含：

30.根据权利要求25至29中任一项所述的组合物或试剂盒，进一步包含盐。

31.根据权利要求30所述的组合物或试剂盒，其中所述盐是无机盐，任选地其中所述盐是licl或nacl。

32.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述盐以至少约0.1m且小于约1.0m或至少约0.2m且小于0.8m的浓度存在。

33.根据权利要求25至32中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二乙基亚砜或其混合物。

34.根据权利要求25至28或30至33中任一项所述的组合物，包含浓度为每总体积至少约50％且小于95％的有机溶剂。

35.根据权利要求25至28或30至34中任一项所述的组合物，进一步包含浓度为每总体积小于20％、优选地小于10％的水或水性缓冲液。

36.根据权利要求25至35中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述碳二亚胺是edc。

37.根据权利要求29至31、33或36中任一项所述的试剂盒，其进一步包含水性缓冲液，任选地其中所述水性缓冲液是mes或咪唑缓冲液。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述水性缓冲液包含在约5.0和约7.0之间的ph。

39.根据权利要求25至28或30至36中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有在约4.5和约7.0之间的ph。

40.根据权利要求25至28或30至36和39中任一项所述的组合物，其中所述核酸具有在约10和约10,000pmol/mg载体之间或在约50和约5,000pmol/mg载体之间的浓度。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体选自颗粒、球、微米颗粒、纳米颗粒、珠，任选地其中所述载体是单分散的。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是磁性的。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是发荧光的。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体选自dynabeadstm m-270carboxylic acid、dynabeadstm myonetm carboxylic acid、carboxyl、sera-magtmmagnetic羧酸酯修饰的颗粒、super paramagneticmicrospheres、promagtm 1 series cooh surfactant-free microspheres、absolutemagtm carboxyl magnetic particles、magnospheretmms160/carboxyl颗粒、mono magcarboxylic acid beads、microspheres或carboxylate-modifiedfluospherestm。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是聚苯乙烯聚合物颗粒。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是多孔的，任选地其中所述载体具有在约50％和约70％之间的孔隙率。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子是dna。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子是单链的。

49.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子选自寡核苷酸、引物、探针、锁核酸或适体。

50.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子被标记，任选地其中所述标记物选自荧光染料、生物素或碱性磷酸酯。

51.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述至少一个伯胺官能团位于所述核酸分子的5’末端或3’末端。

52.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述至少一个伯胺官能团和所述核酸分子的5′或3’末端被间隔链隔开。

53.根据权利要求52所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述间隔链是包含3、6或12个亚甲基的疏水链。

54.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子具有约15至约50个碱基的长度。

55.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子含有一个或多个碱基类似物，如pna或lna。

56.一种组合物，其包含：

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述珠是磁性的。

技术总结
本发明涉及用于将核酸偶联至官能化的表面或载体的方法和组合物。尤其，本发明提供了一种用于将胺化的核酸偶联至被羧酸基团官能化的载体的改进方法，其中在有机溶剂存在下进行所述偶联反应。本发明进一步涉及用于执行所述偶联反应的组合物和试剂盒以及加载核酸的载体用于多种应用的用途。

技术研发人员：L·乔伯特
受保护的技术使用者：生命技术股份公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17