番茄SlMIS1基因及其在提高番茄耐高温能力中的应用

本发明属于农作物基因工程及分子生物学，涉及番茄slmis1基因及其在提高番茄耐高温能力中的应用。

背景技术：

1、温度能直接或间接影响作物的生长发育，从而影响作物的产量及品质。高温往往通过影响作物的开花时间，导致花粉败育、受精失败、坐果率低等问题，从而直接影响作物产量。其次，可通过影响叶绿素的合成，光合作用减弱，使有机物合成减少，间接影响作物产量。探究农作物应对高温的关键基因，并通过基因工程手段提高农作物对高温的耐受性具有十分重要的意义。

2、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,mapk)级联途径是植物细胞将胞外刺激信号转化为胞内反应的主要途径之一，是信号转导的重要中枢节点，有植物细胞“神经中枢”之称，被认为广泛参与植物的生长发育和对环境的适应过程。mapk级联通路是真核生物中高度保守的重要信号模块，它们在传感器或质膜受体的下游发挥作用，通过协调各种细胞反应来调节植物的生长、发育及对不断变化的环境的适应。

3、mapk级联通路的生物学功能主要由mapks磷酸化的下游靶蛋白决定，其中大多数为转录因子(tfs)，但参与激素生物合成、激素运输、rna加工和微管调控的蛋白质也可能是mapks的底物。mapk级联是参与植物整个生长发育过程中一个重要的信号传导模块，其下游底物的多样性使mapk级联能调控不同的生物过程。不断深入的分子、细胞和生化研究也表明了mapk底物在植物生长发育进程中发挥了重要作用，包括胞质分裂、繁殖和叶片衰老等方面。mapk底物在非生物胁迫信号传导中也起着重要作用。

4、番茄(solanum lycopersicum)是茄科茄属番茄亚属的多年生草本植物，富含多种维生素，营养价值与药用价值较高，在果蔬中占有重要地位。此外，番茄最适生长温度在28℃左右，生长发育极易受到高温影响。并且番茄基因组较小，易于转化，是常用的模式植物。研究番茄不仅可以直接促进番茄产业的发展，也能为研究其他植物对高温的响应机制提供实验思路和理论依据。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术存在的问题，提供番茄slmis1基因及其在提高番茄耐高温能力中的应用。

2、涉及番茄slmis1基因及如何利用定点突变体slmis1s44a(去磷酸化突变体)、slmis1s44d(持续磷酸化突变体)探究高温胁迫下slmis1 ser-44磷酸化的功能和生理生化响应。本发明尤其涉及如何利用crispr/cas9手段敲除该基因，以提高番茄耐高温能力的应用。

3、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、slmis1基因作为负调控因子在提高番茄耐高温能力中的应用，其特征在于，所述slmis1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、所述slmis1编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

6、所述应用的方法具体为：

7、步骤1，设计slmis1基因的靶序列sgrna；

8、步骤2，构建表达质粒：使用试剂盒，先合成oligo，再制备oligo二聚体，并将oligo二聚体连接至载体bgk015，得到表达质粒；表达质粒通过遗传转化导入番茄植株，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除slmis1基因，以提高番茄耐热性。

9、进一步地，所述设计的slmis1基因的靶序列sgrna为：5'-aggtagatcgagcaaccgat-3'。

10、进一步地，制备oligo二聚体具体为：buffer anneal 18μl，up oligo 1μl，lowoligo 1μl，h2o补充至20μl；混合后95℃加热3分钟，然后以0.2℃/秒缓慢降至20℃；其中引物序列如下：

11、up oligo：gtttaggtagatcgagcaaccgat

12、low oligo：aaacatcggttgctcgatctacct。

13、进一步地，构建表达质粒具体为：crispr/cas vector 2μl，oligo二聚体1μl，enzyme mix 1μl，h2o补充至10μl；在冰上混匀各个组分，混匀后室温20℃反应1小时。

14、进一步地，表达质粒通过遗传转化导入番茄植株，具体为：将表达质粒转化至农杆菌感受态细胞gv3101，挑选阳性菌落通过叶圆盘法进行农杆菌介导的番茄遗传转化。

15、本发明在前期研究的基础上，首先构建了slmis1、slmis1s44a和slmis1s44d的过表达载体并成功转化农杆菌，随后使用叶圆盘法，通过农杆菌介导的侵染进行遗传转化，并在高温胁迫下研究番茄高温表型与生理分析，通过在高温胁迫下分析番茄表型、dab和nbt染色、抗氧化防护酶活性测定分析，发现高温胁迫下，与野生型相比，slmis1-oe和slmis1s44a-oe过表达植株高温耐受性降低，而slmis1s44d-oe植株与野生型植株没有区别。

16、通过crispr/cas9基因编辑技术获得slmis1敲除株系，经高温处理后，发现与野生型相比，slmis1敲除突变体更耐高温。

17、本发明具有以下技术效果：

18、(1)本发明通过构建slmis1基因的过表达材料，进行耐热性分析，结果初步阐明了slmis1基因在番茄响应高温胁迫过程中的功能机理，可为培育抗高温的番茄作物新品种提供新的基因资源。

19、(2)本发明首次通过crispr/cas9基因编辑技术获得了slmis1基因的突变体植株，并进行功能研究。耐热性分析结果表明，突变体植株较野生型更耐高温，进一步验证上述结果。因此，本发明将为育种工作者提供新的育种思路。

技术特征：

1.slmis1基因作为负调控因子在提高番茄耐高温能力中的应用，其特征在于，所述slmis1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述slmis1编码的氨基酸序列如seq idno.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法具体为：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述设计的slmis1基因的靶序列sgrna为：5'-aggtagatcgagcaaccgat-3'。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备oligo二聚体具体为：buffer anneal18μl，up oligo 1μl，low oligo 1μl，h2o补充至20μl；混合后95℃加热3分钟，然后以0.2℃/秒缓慢降至20℃；其中引物序列为：

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建表达质粒具体为：crispr/cas vector2μl，oligo二聚体1μl，enzyme mix 1μl，h2o补充至10μl；在冰上混匀各个组分，混匀后室温20℃反应1小时。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，表达质粒通过遗传转化导入番茄植株，具体为：将表达质粒转化至农杆菌感受态细胞gv3101，挑选阳性菌落通过叶圆盘法进行农杆菌介导的番茄遗传转化。

技术总结
本发明属于农作物基因工程及分子生物学技术领域，涉及番茄SlMIS1基因及其在提高番茄耐高温能力中的应用，基因SlMIS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄SlMIS1基因敲除的突变体株系，发现高温处理后，与野生型相比，SlMIS1突变体株系（slmis1）更耐高温，说明SlMIS1基因负调控番茄的耐高温性；本发明为培育抗高温的番茄作物新品种提供了新的基因资源，具有较好的应用价值，同时也为研究植物应答高温的分子机制提供了实验思路和理论基础。

技术研发人员：朱雯琪,丁海东,蒋海龙,赵雨乐
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27