一种胎盘来源有核细胞的分离方法与流程

本发明涉及细胞分离，具体是一种胎盘来源有核细胞的分离方法。

背景技术：

1、胎盘，嵌于子宫壁中，是孕期支持胎儿和母体之间进行各种物质交换并兼具内分泌等功能的器官。一直以来，胎盘属于分娩过程中所产生的废弃物，然而近年来研究发现胎盘中存在多种干细胞和免疫细胞等有核细胞，因而受到越来越多的关注和探索。干细胞和免疫细胞等有核细胞具有重要的临床意义，因此，如何从胎盘中成功且高效地分离获得有核细胞成为研究的热点。

2、目前，从胎盘中提取有核细胞的方法有多种，如造血干细胞动员灌流法、涮洗法和多种酶混合消化法等，采用这些方法均能从胎盘中分离得到有核细胞，但是上述方法也存在不足之处。如灌流法需要采用大量冲洗液及使用特殊管道和设备，对操作人员的专业素养要求有较为严苛，并且灌流法通常采用敞口化操作，敞口化操作会有微生物污染风险且不利于规模化生产。涮洗法其原理简单，使用2～4l涮洗液冲洗胎盘小叶表面至无色，涮洗法具有操作简便的优势，但涮洗法对于胎盘血管壁上的造血干细胞存在提取不充分的问题，导致获得的有核细胞的数量较少。多种酶混合消化法，需要使用多种酶类结合协同作用，才能得到较好的分离效果，使用多种酶类会导致成本高昂，不合适生产转化。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提出一种胎盘来源有核细胞的分离方，采用低体积涮洗法结合accutase酶消化法进行，不仅操作简便，成本低，易于转化生产，而且能有效降低离心后的细胞损失，提高有核细胞的提取量。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种胎盘来源有核细胞的分离方法，包括如下步骤：

4、(1)将胎盘小叶组织浸泡于200～300ml的抗凝缓冲液中进行第一次涮洗，并挤压残留在胎盘小叶组织里的血液，将第一次涮洗后的液体全部回收至离心瓶中；

5、(2)将胎盘小叶组织进行破碎，采用200～300ml的抗凝缓冲液将破碎后的胎盘小叶组织进行第二次涮洗，将第二次涮洗后的滤液回收至步骤(1)的离心瓶中；

6、(3)向第二次涮洗后的胎盘小叶组织中加入accutase酶消化液，进酶消化处理，过滤，得到单细胞悬液；

7、(4)将步骤(2)处理后离心瓶中回收的细胞悬液和步骤(3)得到的单细胞悬液混合后，进行离心处理，吸弃上清液；

8、(5)向步骤(4)离心处理后的细胞沉淀中加入生理盐水进行稀释，得到细胞悬液，向细胞悬液中加入淋巴细胞分离液后，进行离心处理；

9、(6)离心处理后，吸取离心管中部的白膜层细胞，将白膜层细胞依次进行洗涤和离心，弃去上清液，下层细胞用生理盐水重悬，得到有核细胞悬液；

10、(7)将有核细胞悬液用冻存液冻存。

11、优选地，在步骤(3)中，胎盘小叶组织和accutase酶消化液的体积比为1：(1.5～2.5)。

12、优选地，步骤(3)的操作方法包括如下步骤：向第二次涮洗后的胎盘小叶组织中加入accutase酶消化液，分装至解离管并安装在组织解离仪器中，按解离脾脏程序进行酶消化处理，程序停止后，过滤，得到单细胞悬液。

13、优选地，在步骤(5)中，淋巴细胞分离液和细胞悬液的体积比为(12～18)：(20～30)。

14、优选地，步骤(6)的操作方法包括如下步骤：离心处理后，吸取离心管中部的白膜层细胞，加入2～4倍体积的生理盐水洗涤白膜层细胞，洗涤后在1600～2000rpm的条件下，离心处理5～20min，离心完成后弃去上清液，下层细胞加入生理盐水重悬，得到有核细胞悬液。

15、优选地，步骤(1)的操作方法包括如下步骤：

16、将胎盘组织置于无菌容器中，加入200～300ml抗凝缓冲液将胎盘组织完全浸没，将胎盘组织中中丛密绒毛膜组织剪下，暴露出胎盘小叶组织，将胎盘小叶组织剪下并浸泡在抗凝缓冲液中，进行第一次涮洗，并用镊子充分挤压残留在胎盘小叶组织里的血液，第一次涮洗后的液体全部回收至离心瓶中。

17、优选地，步骤(2)的操作方法包括如下步骤：

18、将胎盘小叶组织进行破碎，使组织块破碎成1～5mm3的碎组织，将破碎后的胎盘小叶组织转移至200目筛网中，加入200～300ml的抗凝缓冲液进行第二次涮洗，涮洗后过滤出残留液体，再使用200～300ml的抗凝缓冲液重复涮洗一次，将两次涮洗后的滤液回收至步骤(1)的离心瓶中。

19、优选地，在步骤(4)中，离心处理的转速1600～2000rpm，离心时间为5～20min。

20、本申请实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

21、1、本技术方案胎盘来源有核细胞的分离方法采用低体积涮洗法结合accutase酶消化法进行，不仅操作简便，成本低，易于转化生产，而且能有效降低离心后的细胞损失，提高有核细胞的提取量，使有核细胞分离效果更佳。

22、2、相对于常规使用灌流法、涮洗法和多种酶混合消化法，本技术方案的分离方法采用低体积涮洗法和accutase酶消化法的结合，作用效果温和，有核细胞分离效果更佳。同时，相对于常规的多种酶混合消化法，本方案只需要使用accutase酶进行酶消化处理，不仅具有成本低的优势，而且能消化胎盘血管内壁的造血干细胞，提高造血干细胞的提取量。

技术特征：

1.一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种胎盘来源有核细胞的分离方法，特征在于，在步骤(3)中，胎盘小叶组织和accutase酶消化液的体积比为1：(1.5～2.5)。

3.根据权利要求2所述的一种胎盘来源有核细胞的分离方法，特征在于，步骤(3)的操作方法包括如下步骤：向第二次涮洗后的胎盘小叶组织中加入accutase酶消化液，分装至解离管并安装在组织解离仪器中，按解离脾脏程序进行酶消化处理，程序停止后，过滤，得到单细胞悬液。

4.根据权利要求1所述一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，在步骤(5)中，淋巴细胞分离液和细胞悬液的体积比为(12～18)：(20～30)。

5.根据权利要求1所述一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，步骤(6)的操作方法包括如下步骤：离心处理后，吸取离心管中部的白膜层细胞，加入2～4倍体积的生理盐水洗涤白膜层细胞，洗涤后在1600～2000rpm的条件下，离心处理5～20min，离心完成后弃去上清液，下层细胞加入生理盐水重悬，得到有核细胞悬液。

6.根据权利要求1所述一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，步骤(1)的操作方法包括如下步骤：

7.根据权利要求1所述一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，步骤(2)的操作方法包括如下步骤：

8.根据权利要求1所述一种胎盘来源有核细胞的分离方法，其特征在于，在步骤(4)中，离心处理的转速1600～2000rpm，离心时间为5～20min。

技术总结
本发明公开了一种胎盘来源有核细胞的分离方法，涉及细胞分离技术领域。本发明胎盘来源有核细胞的分离方法，采用低体积涮洗法结合Accutase酶消化法进行，不仅操作简便，成本低，易于转化生产，而且能有效降低离心后的细胞损失，提高有核细胞的提取量，使有核细胞分离效果更佳。

技术研发人员：许峻荣,冯嘉昆,吴远武,武岳,陈智聪,黄茵茹,魏鲁宁,王进辉
受保护的技术使用者：广东唯泰生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31