一种白斑综合征病毒一步式PCR检测方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,wssv)的pcr检测引物，本发明还涉及一种wssv一步式pcr检测方法。

背景技术：

1、wssv是一种有囊膜的环状双链dna病毒，可感染克氏原螯虾、南美白对虾等多种经济甲壳动物，是迄今为止危害最为严重的一种甲壳动物病毒，被列入世界动物卫生组织(world organization for animal health,woah)发布的《水生动物卫生法典》中，农业农村部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》则将其定为水生动物二类疫病。

2、wssv除了具有感染宿主广泛的特点，其传播途径也非常复杂，包括种内水平传播、种内垂直传播和种间传播。另外，已有研究表明wssv在宿主体内存在潜伏感染期，一旦达到感染阈值，便迅速爆发，导致7-10天内死亡率高达100％。这些感染特征和发病特点使wssv难以治疗，加上目前对其致病机制等方面的深入研究仍然不足，阻碍了有效治疗方法的发展。因此，预防成为当前可采取的关键措施之一，而建立快速、便捷且灵敏的检测方法也成为了研究的重点。

3、wssv的检测方法主要包括组织病理学诊断、电镜观察、免疫学检测和核酸分子检测等。核酸分子检测是目前最常用的wssv检测方法，其中巢式聚合酶链式反应(巢式pcr)灵敏性高、特异性强。1996年开发的巢式pcr检测方法于2009年被纳入woah的wssv检测标准，但该方法需要使用两对引物依次分别进行两轮pcr反应，操作复杂，耗时长，且易出现非特异性扩增影响结果准确性。相比之下，荧光定量pcr灵敏性更高，耗时短，最低可检测到单个病毒拷贝，但它需要特定的荧光试剂盒和昂贵的荧光定量pcr仪，高成本和操作专业性限制了其在实际生产中的应用。一步式pcr法可以在实际生产中快速扩增wssv，短时间内实现大批量样本检测且成本低，但目前该方法灵敏性最低检测限为102个病毒拷贝，灵敏性仍较低。因此，本发明提供了一种wssv一步式pcr检测方法，这种方法实验操作简单，耗时短，同时具有强特异性、高灵敏性和高检出率的优点，可应用于包括克氏原螯虾等经济类甲壳动物中wssv的快速大规模检测，表现出广泛的实际生产应用性，可以使白斑综合征做到“早发现，早预防”。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测wssv的pcr引物及其应用。

2、为实现上述目的，申请人基于wssv病毒基因组(accession no.af332093)主要囊膜蛋白vp19基因设计了一对特异引物v1，引物v1的序列如seq id no.2～3所示，该引物能扩增vp19基因的一段196bp片段，所述vp19基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、上述引物仅能从wssv病毒的基因组dna中扩增出目的片段，而对其它常见水产病原没有扩增产物，因此可用于wssv的特异性检测。本发明中的其它水产病原包括四种病毒(ihhnv、cmnv、rgv和svcv)和五种细菌(aeromonas veronii、aeromonas caviae、citrobacter freundii、citrobacter braakii、acinetobacter junii)。

4、上述引物还具有扩增效率高的优点，能够从极少量的样品中扩增出目的片段，能显著提高pcr检测的灵敏度。

5、因此，本发明提供的pcr引物能应用于制备克氏原螯虾白斑综合征的诊断试剂盒。

6、本发明进一步提供了一种试剂盒，该试剂盒是用于诊断克氏原螯虾白斑综合征的pcr试剂盒，试剂盒中含有所述的pcr引物。

7、进一步地，所述试剂盒中还含有pcr反应混合液、ddh2o以及阳性对照，其中，所述阳性对照是从人工感染wssv的克氏原螯虾的鳃组织提取的基因组dna。

8、本发明还提供了一种检测wssv的方法，具体而言，该方法是检测wssv的一种一步式pcr方法，包括以下步骤：

9、1)提取待测样品的基因组dna；

10、2)以提取的基因组dna为模板，使用所述的pcr引物进行扩增；

11、3)对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

12、优选地，所述扩增反应体系为2x taq mastermix 10μl，dna模板1μl，上游引物和下游引物各1μl，ddh2o 7μl。

13、进一步优选地，所述扩增反应程序为95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸5min。

14、该方法能特异性检测wssv，与现有的方法相比，本发明更加快速便捷、低成本、操作简单，而且该方法有很高的灵敏性和检出率，因此在实际生产中具有很高的应用价值，其中，本发明对标准质粒的检测理论灵敏性可达单拷贝(1.83copies/μl)，对临床样品的诊断灵敏性为0.82fg，对临床样品的检出率为90.48％。

15、本发明所提供的方法不仅能应用于克氏原螯虾白斑综合征的疾病诊断，同时也能应用于以非疾病诊断为目的的wssv病毒实验室筛查鉴定。

16、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

17、1)本发明是基于wssv主要囊膜蛋白vp19设计了一对引物v1(v1-f和v1-r)，是一种新的靶标序列选择。

18、2)本发明设计的引物可以应用于克氏原螯虾等经济甲壳动物wssv的特异性检测。

19、3)本发明提供的克氏原螯虾一步式pcr检测方法在标准质粒模板检测时理论灵敏性可达单拷贝(1.83copies/μl)，与荧光定量pcr灵敏性一致，比woah巢式pcr灵敏性高100倍。

20、4)本发明提供的克氏原螯虾一步式pcr检测方法在临床样品检测时诊断灵敏性为0.82fg，而woah巢式pcr的灵敏性为0.82pg，两者相差1000倍。

21、5)本发明提供的克氏原螯虾一步式pcr检测方法，在临床样品检测中检出率为90.48％，对比woah巢式pcr，检出率高出10％。

22、6)本发明提供的克氏原螯虾一步式pcr检测方法，真正做到了低成本、易操作、快检测和高灵敏等优点，可以应用于克氏原螯虾wssv的早期诊断，或大批量检疫样品的快速检测。

技术特征：

1. 一种用于检测白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, wssv）的pcr引物，其序列如seq id no.2～3所示，该引物能扩增wssv病毒主要囊膜蛋白vp19基因的196 bp片段。

2.权利要求1所述的pcr引物在制备克氏原螯虾白斑综合征诊断试剂盒中的用途。

3.一种克氏原螯虾白斑综合征诊断试剂盒，该试剂盒中含有权利要求1所述的pcr引物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒中还含有pcr反应混合液、ddh2o。

5.一种非诊断目的检测wssv的一步式pcr方法，其特征在于包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的一步式pcr方法，其特征在于：所述扩增反应体系为2x taqmastermix 10µl，dna模板1µl，上游引物和下游引物各1µl，ddh2o 7µl。

7.如权利要求5所述的一步式pcr方法，其特征在于：所述扩增反应程序为95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸5min。

技术总结
本发明公开了一种用于检测白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）的PCR引物，其序列如SEQ ID NO.2～3所示，该引物能扩增WSSV病毒主要囊膜蛋白VP19基因的196bp片段，本发明还公开了一种检测WSSV的一步式PCR方法，该方法能够特异性检测WSSV，是一种快速且具有极强灵敏性的检测方法，相比于巢式PCR标准检测方法，本发明扩增反应时长缩短了66.13%，理论和诊断灵敏性最低检出限分别为1.83copies/μL和0.82fg/μL，分别提高了100和1000倍。

技术研发人员：顾泽茂,罗小红,廖明聪,陈楠,胡瑞雪
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17