酿酒酵母外源启动子及其在合成生物学中的应用的制作方法

本发明涉及合成生物学领域，具体涉及酿酒酵母外源启动子及其在合成生物学中的应用。

背景技术：

1、近年来，随着合成生物学技术的发展和成熟，越来越多的微生物等细胞工厂被用来生产食品、化妆品、药物、功能材料或能源替代品等高附加值产品。合成生物学是通过人工设计并构建新的或改造已有的具有特定生理功能的生物系统，从而实现特定化合物的生物合成并提高其产量。

2、酿酒酵母由于其遗传背景清晰、分子操作简单、发酵工艺成熟、生物安全性高等特点，被广泛地应用到合成生物学中作为底盘细胞来生产高附加值化合物。但往往利用酿酒酵母自身的合成通路来生产特定化合物时，产量较低，难以满足工业化需求。为了提高产量，我们常常需要对合成通路上的关键酶进行过表达。过表达是指把基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，基因表达产物超过正常水平。常将目的基因与高强度启动子融合构建成质粒载体，通过转化，获得该基因产物的大量积累。启动子是指位于结构基因5’端上游，可被rna聚合酶特异性识别和结合从而实现转录起始的一段特殊dna序列，作为基因的一个组成部分，启动子本身并不影响基因编码后的蛋白序列，而是通过调控基因的表达水平来影响其编码的蛋白在生化反应中所发挥的作用。

3、酿酒酵母中常用的过表达启动子包括半乳糖诱导型强启动子gal1p、gal2p、gal7p、gal10p等，以及组成型强启动子tdh3p、pgk1p、tef1p等。实际研究和应用中，一些合成通路上需要过表达的基因众多，而可使用的启动子非常有限，重复使用同一种启动子往往会造成基因组的不稳定性。因此，我们需要更多的强启动子元件和更高强度的启动子元件，以帮助我们改造酿酒酵母中的合成通路、提高所需化合物的产量。

技术实现思路

1、本发明的目的是拓展用于酿酒酵母的强启动子元件库，以用于合成生物学菌株改造，从而实现优化合成通路、提高所需化合物产量的目的。

2、本发明披露了启动子，是如下(1)或(2)或(3)所示的dna分子：

3、(1)核苷酸序列是sqe id no:1-sqe id no:21任一所示的dna分子，

4、(2)与(1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同源性且具有启动子功能的dna分子，

5、(3)与(1)限定的核苷酸序列在3’端200bp内具有90％或90％以上同源性且具有启动子功能的dna分子。

6、表1

7、

8、本发明披露了含有至少2个所述启动子的启动子库，组成所述启动子库的启动子具有相同、相近、不相同或不相近的强度。所述启动子库可以用于多基因的差异化表达调控。

9、本发明披露了含有至少1个所述启动子的表达盒，所述表达盒可包括启动子区、结构基因区和终止子区。所述启动子区含有所述启动子。所述结构基因对宿主细胞而言可以是同源的或者异源的、天然的或者经过人工改造的。所述结构基因可选自角鲨烯合成通路上的关键基因，例如：erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、erg9。构建表达盒的方法可以是融合pcr、golden gate组装、gibson组装、体内同源重组等。

10、本发明披露了含有至少1个所述启动子的重组质粒(或称重组载体)，所述重组质粒是将至少1个所述启动子插入出发质粒得到的重组质粒，或者，所述重组质粒含有所述表达盒。所述出发质粒可是常用于酿酒酵母的质粒，例如：yep、yip、yac。所述重组质粒上还可包含用于筛选已转化有重组质粒的选择性标记基因，例如编码抗生素抗性的基因。

11、本发明披露了含有至少1个所述启动子的重组微生物，所述重组微生物是将所述重组质粒转化进入出发微生物(底盘微生物)得到的，或者将所述表达盒插入到出发微生物的基因组上得到的。所述出发微生物是酿酒酵母种(saccharomyces cerevisiae)的微生物，包括酿酒酵母种的所有小种和变种的菌株，例如cen.pk2 1c、by4741等。

12、本发明披露了所述启动子、所述启动子库、所述表达盒或所述重组质粒在启动结构基因的表达中的用途，包括增强或弱化结构基因的转录、多基因的差异化表达调控。所述表达包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修改和分泌。进一步地，本发明披露了所述启动子在酿酒酵母中增强角鲨烯合成通路关键基因的表达方面的用途，所述酿酒酵母包括saccharomyces cerevisiae种下所有变种的菌株，所述角鲨烯合成通路关键基因包括：erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、erg9。

13、本发明披露了使用所述启动子启动基因的表达的方法，包括将所述启动子插入到任何结构基因的上游，或者将结构基因插入到所述表达盒中启动子的下游，或者将结构基因插入到所述重组质粒中启动子的下游。进一步的，所述方法还包括将表达盒插入到出发微生物的基因组上，或者，将重组质粒转化进入出发微生物。

14、本发明披露了使用所述启动子增强酿酒酵母中角鲨烯合成通路关键基因的表达的方法，是将seq id no:5或seq id no:19所示的启动子插入到角鲨烯合成通路关键基因的上游并构建成表达盒，再将表达盒插入到酿酒酵母的基因组上，所述角鲨烯合成通路关键基因包括：erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、erg9。表达盒在酵母基因组上的插入位点可以是ars511b或ars911b。优选的，所述表达盒构建到两个载体上，分别插入到酿酒酵母基因组的ars511b和ars911b位点，优选的，第一位点插入的表达盒是：sp5p-erg10-adh1t/sp19p-erg13-tdh1t/sp19p-thmg1-cyc1t/psp5-erg12-eno1t/sp5p-erg8-tef2t，第二位点插入的表达盒是：sp19p-erg19-cyc1t/sp19p-idi1-tdh1t/sp5p-erg20-adh1t/sp19p-erg9-enot。

15、本发明提供获得所述启动子的方法，包括如下步骤：

16、步骤1：根据酿酒酵母之外的各种其他酵母菌株的基因组注释信息，选取各基因前700bp的dna序列作为启动子区域，将所有的启动子区域利用生物信息学方法预测启动子的强度，并进行步骤2的实验验证；

17、步骤2：合成启动子的dna序列，通过golden gate的方法连接上报告基因gfp并转化到酵母细胞中，通过检测gfp的绿色荧光强度来分析启动子的相对强度。

18、本发明通过生物信息学结合分子生物学的方法，预测并筛选到了21个可用于酿酒酵母中的外源启动子元件，拓展了酿酒酵母现有启动子元件库。其中，两个启动子的强度分别是目前酿酒酵母中最常用的强启动子gal1p强度的2.9倍和3.2倍。这些启动子拓展了合成生物学的启动子元件库，而且有利于用来加强合成通路、提高所需化合物的产量。

19、利用本发明筛选到的两个最强启动子(seq id no:5、seq id no:19)对酿酒酵母产角鲨烯合成途径上的关键基因进行了过表达，使角鲨烯在10l发酵罐上的产量达到了31.3g/l，为目前报道的最高产量。