基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法与流程

本发明属于细胞基因治疗领域，涉及一种基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，具体涉及一种在三维多孔微载体上进行培养的细胞中实现基因载体，例如慢病毒质粒、腺病毒质粒、腺相关病毒(aav)质粒，转染及病毒载体生产的方法。

背景技术：

1、近年来，基因治疗药物的病毒载体因其高转染效率和稳定的转基因表达而在体内和体外得到广泛应用。常用的病毒载体包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。腺相关病毒、腺病毒等常用于体内直接表达，而慢病毒等常用于体外表达。基因治疗让我们能够治疗“无法治愈”的疾病，也为其他疾病带来新的治疗思路。目前基因治疗的主要应用场景是治疗罕见病，随着递送系统不断成熟，基因治疗一次给药即可实现彻底治愈的特性对病人吸引力越来越大，越来越多的在研发人员将应用场景从罕见病拓展到常见病。然而，作为一种“革命式”的新型疗法，基因治疗也面临诸多挑战。

2、目前悬浮细胞培养常见于生产病毒载体，但悬浮细胞是由贴壁细胞“改造”而来的。由于改造的悬浮细胞不是在细胞本身的自然状态，行为方式不同，往往会比贴壁细胞提供更低的产量，因此在大规模生产方面存在许多挑战。要实现真正的工业化，还需要更可靠、可放大的解决方案。微载体结合大规模自动化生物反应器，为贴壁细胞的悬浮培养提供了可能性。

3、微载体培养是目前公认最具发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且容易放大。该技术已广泛用于培养各类型细胞，如293细胞、成肌细胞、vero细胞、人二倍体细胞。目前市面常用微载体包括实心球结构和多孔微粒结构，例如，本发明专利中使用三维多孔可降解微载体。与实心球结构的微载体相比而言，通过与生物反应器相结合实现细胞悬浮培养，三维多孔可降解微载体比表面积更大，单位体积内细胞密度得到大幅度提高，同时可降解特性可实现细胞无损收获，收获效率更高。然而，在基因治疗领域病毒载体生产中，目前采用的依然是二维培养，或实心微载体培养，细胞附着在实心微载体表面上培养生长，而尚未有报道将三维多孔微载体应用于基因治疗领域病毒载体生产，三维多孔微载体培养细胞是否可用于基因载体如质粒的转染仍然是个未知数，普遍认为使用三维多孔微载体进行细胞培养以用于基因载体转染时，三维多孔结构将妨碍基因载体进入细胞，从而影响转染效率，无法实现经济上可行的规模化病毒生产。因此，亟需开发建立新的细胞培养方法以用于基因治疗领域病毒生产。

技术实现思路

1、尽管本领域中普遍认为利用三维多孔微载体培养细胞不利于基因载体进行转染，无法实现经济上可行的规模化病毒生产，本发明人出乎意料地发现采用三维多孔微载体在动态培养条件下能够进行高效率的基因载体转染，其效果媲美甚至超越二维培养，进而实现经济上可行的规模化病毒生产。因此，本发明的目的是提供一种在三维多孔微载体进行培养的细胞中进行基因载体(以下以质粒为代表性基因载体)的转染方法。本发明的方法基于三维多孔微载体，与现有技术中报道的方法相比，本发明的方法具有大规模、可降解微载体以温和收获细胞实现逐级放大、三维仿生环境使转染后细胞存活时间长优点。

2、在一方面，本发明提供了一种基于三维多孔微载体的质粒转染方法，包括以下步骤：

3、(1)将细胞悬液与三维多孔微载体悬液相混合，并在生物反应器进行细胞培养；

4、(2)用基因载体转染细胞，并培养实现细胞产毒；

5、(3)收获病毒。

6、在一些实施方案中，所述三维多孔微载体选自由胶原、明胶(变性胶原)、壳聚糖、透明质酸、和/或海藻酸钠的材料制成。

7、在一些实施方案中，进行细胞培养时，三维多孔微载体的浓度是0.5-12g/l，优选为1-10g/l，更优选为1-5g/l。

8、在一些实施方案中，所述生物反应器包括连续搅拌罐生物反应器和波浪式一次性反应器

9、在一些实施方案中，所述生物反应器是连续搅拌罐生物反应器，步骤(1)进行细胞培养时采用间速培养和恒速培养的组合，间速培养时以较高速约30rpm至80rpm进行约5-10分钟；以较低速约1rpm至5rpm进行约25-35分钟；较高速搅拌和较低速搅拌交替进行；在约4-36小时以后改为恒速培养，以较高速约30rpm至80rpm进行约24-96小时。

10、在一些实施方案中，所述生物反应器是连续搅拌罐生物反应器，步骤(2)转染后0-12小时采用恒速或间速培养，随后以较高速例如约30rpm至80rpm进行约12-240小时或者更长的时间。

11、在一些实施方案中，步骤(2)转染培养时采用恒速培养，以较高速例如约30rpm至80rpm进行约24-240小时或者更长的时间。

12、在一些实施方案中，所述生物反应器是连续搅拌罐生物反应器，步骤(2)转染后0-12小时采用间速培养，随后以较高速例如约30rpm至80rpm进行约12-240小时或者更长的时间。

13、在一些实施方案中，所述生物反应器是波浪式一次性反应器，步骤(1)进行细胞培养时采用间速培养和恒速培养的组合，间速培养时以较高速约7rpm至10rpm进行约5-10分钟；静止约25-35分钟；较高速搅拌和静止交替进行；在约4-36小时以后改为恒速培养，以约7rpm至10rpm进行约24-96小时或者更长的时间，倾斜角度约3°-10°。

14、在一些实施方案中，所述生物反应器是波浪式一次性反应器，步骤(2)转染培养时采用恒速培养，以约7rpm至10rpm进行约24-240小时或者更长的时间。

15、在一些实施方案中，转染后进行细胞培养的时间为约24小时至240小时。

16、在一些实施方案中，所述细胞选自293t细胞。

17、在一些实施方案中，所述基因载体包括慢病毒质粒、腺相关病毒质粒、腺病毒质粒。

18、在一些实施方案中，转染后进行细胞培养的条件包括：37℃，5％ co2。

19、在一些实施方案中，还包括纯化病毒的步骤。

20、在一方面，本发明提供了三维多孔微载体用于病毒载体生产的用途。

技术特征：

1.一种基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述三维多孔微载体由选自胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸、和/或海藻酸钠的材料制成。

3.根据权利要求1或2所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，进行细胞培养时，三维多孔微载体的浓度是0.5-12g/l，优选为1-10g/l，更优选为1-5g/l。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述生物反应器包括连续搅拌罐生物反应器、波浪式一次性反应器。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述生物反应器是连续搅拌罐生物反应器，步骤(1)进行细胞培养时采用间速培养和恒速培养的组合，间速培养时以较高速约30rpm至80rpm进行约5-10分钟；以较低速约1rpm至5rpm进行约25-35分钟；较高速搅拌和较低速搅拌交替进行；在约4-36小时以后改为恒速培养，以较高速约30rpm至80rpm进行约24-96小时或者更长的时间。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述生物反应器是连续搅拌罐生物反应器，步骤(2)转染后0-12小时采用恒速或间速培养，随后以较高速例如约30rpm至80rpm进行约12-240小时或者更长的时间。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述生物反应器是波浪式一次性反应器，步骤(1)进行细胞培养时采用间速培养和恒速培养的组合，间速培养时以较高速约7rpm至10rpm进行约5-10分钟；静止约25-35分钟；较高速搅拌和静止交替进行；在约4-36小时后改为恒速培养，以约7rpm至10rpm进行24-96小时或者更长的时间，倾斜角度约3°-10°。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述生物反应器是波浪式一次性反应器，步骤(2)转染培养时采用恒速培养，以约7rpm至10rpm进行约24-240小时或者更长的时间。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述细胞选自293t细胞。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，所述基因载体包括慢病毒质粒、腺相关病毒质粒、腺病毒质粒。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，其中，进行转染时的细胞培养条件包括：37℃，5％co2。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，还包括纯化病毒的步骤。

13.三维多孔微载体用于病毒载体生产的用途。

技术总结
一种基于三维多孔微载体的病毒载体生产方法，具体涉及一种在三维多孔微载体上进行培养的细胞中实现基因载体，例如慢病毒质粒、腺病毒质粒、腺相关病毒(AAV)质粒，转染并生产病毒的方法。

技术研发人员：鄢晓君,刘伟,赵红莉,张元元,徐环叶,刘少丹
受保护的技术使用者：北京华龛生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15