α-淀粉酶突变体的制作方法

本发明涉及α-淀粉酶的突变体。

背景技术：

1、α-淀粉酶除了在淀粉产业、酿造产业、纤维产业、医药品产业和食品产业等广泛的产业领域中利用以外，也已知具有在清洁剂中的配合适应性，作为去除淀粉质的污垢的成分，配合在自动餐具清洗机用的餐具清洁剂或衣物用洗涤剂等中。

2、作为在清洁剂用途中有用的α-淀粉酶，已知有来自芽孢杆菌(bacillus sp.)ksm-1378(ferm bp-3048)株的α-淀粉酶ap1378(专利文献1)、作为来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的termamyl或duramyl(注册商标)，除此以外，还有来自芽孢杆菌(bacillus sp.)dsm12649株的α-淀粉酶aa560(专利文献2)、来自芽孢杆菌(bacillus sp.)sp722株的α-淀粉酶sp722(专利文献3的序列号4)、来自噬纤维菌属的α-淀粉酶cspamy2(专利文献4)、来自杆菌属的α-淀粉酶aai10的a和b结构域和来自酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillus)种的α-淀粉酶嵌合体labm(专利文献5的序列号13)等。另外，关于这些α-淀粉酶，报道有为了面向特定用途改善功能而进行了改变，例如提高了在洗涤剂中的稳定性的突变体等(专利文献6)。

3、然而，在亲本酶不同的情况下，通过突变不一定能得到同样的效果，特别是特定性质大幅提高的多重突变体的取得需要针对各亲本酶进行大量的努力。

4、另一方面，近年来，已知在低ph环境中的清洗对清洗品温和，并且不如通常使用的碱性组合物那样强力，因此具有将玻璃、带花纹餐具等清洗品长时间保持崭新的外观的效果，另外，有助于释放使布料的恶臭减少、存在捕获布料上的污垢的倾向的钙皂，使对抗ph反应性污渍的性能提高，进而甚至对布料的触感也有益处等。另外，在餐具清洁剂中，除了清洗作为主要清洗对象的餐具类以外，还可以用于不锈钢制或树脂制的水槽周围的清洗，因此有时以高浓度配合发挥对水垢污垢的清洗力的柠檬酸等的螯合剂。因此被认为通过在这样的洗涤剂中添加α-淀粉酶等的酶，能够期待清洗性进一步提高。

5、因此，关于上述的清洁剂用α-淀粉酶，也要求在酸性或包含螯合剂的洗涤剂、特别是酸性且包含螯合剂的洗涤剂中的稳定性的提高。

6、现有技术文献

7、专利文献

8、专利文献1：国际公开第94/26881号

9、专利文献2：国际公开第00/60060号

10、专利文献3：国际公开第06/002643号

11、专利文献4：国际公开第2014/164777号

12、专利文献5：日本特表2018-516553号公报

13、专利文献6：国际公开第98/044126号

技术实现思路

1、本发明涉及以下方案。

2、1)一种α-淀粉酶突变体，其中，所述α-淀粉酶突变体为：分别将相对于序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α-淀粉酶a、相对于序列号6所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α-淀粉酶b、相对于序列号8所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α-淀粉酶c、相对于序列号10所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α-淀粉酶d、或相对于序列号12所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α-淀粉酶e设为亲本淀粉酶的α-淀粉酶突变体a1、b1、c1、d1和e1，该a1～e1分别包含选自相当于序列号1的编号中第178-181位的位置中的2处氨基酸残基的缺失，且包含选自相当于序列号2的编号中第178、181、238、239、240、126、129和201位的位置中的3处以上的氨基酸残基的取代，该取代至少包含下述的a)～e)：

3、a)关于a1，相当于第178位的位置处的氨基酸残基取代为h、相当于第181位的位置处的氨基酸残基取代为e或q、和相当于第239位的位置处的氨基酸残基取代为q；

4、b)关于b1，相当于第178位的位置处的氨基酸残基取代为h、相当于第181位的位置处的氨基酸残基取代为e或q、和相当于第239位的位置处的氨基酸残基取代为q；

5、c)关于c1，选自以下中的3处以上的取代：相当于第178位的位置处的氨基酸残基取代为h、相当于第181位的位置处的氨基酸残基取代为e或q、相当于第238位的位置处的氨基酸残基取代为f、和相当于第239位的位置处的氨基酸残基取代为q；

6、d)关于d1，选自以下中的3处以上的取代：相当于第178位的位置处的氨基酸残基取代为h、相当于第181位的位置处的氨基酸残基取代为e或q、相当于第238位的位置处的氨基酸残基取代为f、和相当于第239位的位置处的氨基酸残基取代为q；

7、e)关于e1，选自以下中的3处以上的取代：相当于第178位的位置处的氨基酸残基取代为h、相当于第181位的位置处的氨基酸残基取代为e或q、相当于第238位的位置处的氨基酸残基取代为f、相当于第239位的位置处的氨基酸残基取代为q、和相当于第240位的位置处的氨基酸残基取代为f。

8、2)一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码1)的突变体。

9、3)一种载体或dna片段，其中，所述载体或dna片段包含2)的多核苷酸。

10、4)一种转化细胞，其中，所述转化细胞含有3)的载体或dna片段。

11、5)一种清洁剂组合物，其中，所述清洁剂组合物包含1)的突变体。

技术特征：

1.一种α-淀粉酶突变体，其中，

2.如权利要求1所述的α-淀粉酶突变体，其中，

3.如权利要求2所述的α-淀粉酶突变体，其中，

4.如权利要求1～3中任一项所述的α-淀粉酶突变体，其中，

5.如权利要求4所述的α-淀粉酶突变体，其中，

6.一种多核苷酸，其中，

7.一种载体或dna片段，其中，

8.一种转化细胞，其中，

9.如权利要求8所述的转化细胞，其中，

10.一种清洁剂组合物，其中，

11.如权利要求10所述的清洁剂组合物，其中，

12.如权利要求11所述的清洁剂组合物，其中，

13.如权利要求11或12所述的清洁剂组合物，其中，

14.如权利要求11～13中任一项所述的清洁剂组合物，其中，

技术总结
本发明提供在低温下显示优异的淀粉分解活性而且在低pH和/或螯合剂存在下显示优异的稳定性的α‑淀粉酶。该α‑淀粉酶是分别将相对于序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α‑淀粉酶A、相对于序列号6所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α‑淀粉酶B、相对于序列号8所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α‑淀粉酶C、相对于序列号10所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α‑淀粉酶D、或相对于序列号12所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的α‑淀粉酶E设为亲本淀粉酶的α‑淀粉酶突变体A1、B1、C1、D1和E1，其中，该A1～E1分别包含选自相当于序列号1的编号中第178‑181位的位置中的2处氨基酸残基的缺失，且包含选自相当于序列号2的编号中第178、181、238、239、240、126、129和201位的位置中的3处以上的氨基酸残基的取代，该取代至少包含下述的a)～e)：a)关于A1，178H；181E或181Q；和239Qb)关于B1，178H；181E或181Q；和239Qc)关于C1，178H；181E或181Q；238F；和239Qd)关于D1，选自178H；181E或181Q；238F；和239Q中的3处以上e)关于E1，选自178H；181E或181Q；238F；239Q；和240F中的3处以上。

技术研发人员：释真绪,日置贵大,川原彰人
受保护的技术使用者：花王株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/11/18