本发明涉及基因诊断领域,具体为一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒。
背景技术:
1、据世界卫生组织国际癌症研究机构(who iarc)发布的2020年最新全球癌症负担数据显示:2020年全球胃癌新发病例数108.9万,死亡病例数76.8万。
2、造成胃癌死亡率高、治愈率低的一个重要因素是早期胃癌的确诊率较低。绝大多数胃癌早期无明显症状,或仅仅出现上腹不适、嗳气等非特异性症状,常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似,易被忽略,大部分患者发现时已为进展期,预后差。临床研究发现,从胃癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要数年时间,这为发现早期胃癌、提高早期胃癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期,有望提高胃癌治疗效果、降低胃癌死亡率。
3、目前胃癌的筛查手段主要有x线钡剂检查、内镜检查和血清学筛查,最终确诊需要病理证实。 然而,这些技术要么检测灵敏性低,如血清肿瘤标志在进展期胃癌中的阳性率仅为20%~30%,在早期胃癌中的阳性率于10%;要么侵入性强,部分人群排斥,如胃镜;要么检测成本较高,不适用于大面积的筛查,如磁控胶囊内镜。在胃癌的检测和诊断的使用受到限制,无法充分满足临床检测的需求。近几年兴起的肿瘤生物标识物(如:胃蛋白酶原)检测技术具有方便、快捷、灵敏、无创等技术优势,便于临床使用和推广,然而,单一肿瘤标识物难以实现理想的肿瘤检测性能。
4、基于此,当前对能够有效提高胃癌的检测效果的检测技术存在需求。因此,开发灵敏、特异的新型胃癌生物标识物和检测技术是提高胃癌检出率、改善胃癌治疗效果、降低胃癌死亡率的重要途径。ctdna甲基化是较为理想的检测标志物。研究表明,抑癌基因甲基化水平升高的现象通常发生在癌症初期,是肿瘤早期发展的标志性改变;而在人类基因组cpg岛中,60-80%的胞嘧啶残基被甲基化修饰,dna甲基化已成为癌症发生发展过程中丰富的信号来源,dna甲基化几乎在所有的肿瘤中都有发生,使其成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。因此,特定基因区域甲基化状态可以作为特定肿瘤检测的标志性事件。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足,本发明提供了一种用于胃癌检测的引物探针组合物及试剂盒,本发明提出的用于检测基因sept9和elmo1特定区域中至少一个区域内多个cpg的甲基化状态,在血浆样本中实现胃癌的较高特性和灵敏度的检测,在组织样本中,可以显著区分癌组织和正常组织(癌旁组织)。
2、为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
3、一种用于胃癌检测的引物探针组合物,包括特异性检测基因sept9甲基化区域的引物和荧光探针、特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物和荧光探针、内参基因col2a1的特异性引物和探针;
4、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的引物序列为:
5、sept9-f:agttggaaatgattttatttagttg(seq id no:1);
6、sept9-r:ccaccaaccatcatatc(seq id no:2);
7、所述特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物序列为:
8、elmo1-f:tttggggtcgtaggatagtagc(seq id no:3);
9、elmo1-r:caattccccttcaataataacga(seq id no:4);
10、所述内参基因col2a1的特异性引物序列为:
11、col2a1-f:gtaatgttaggagtattttgtgggta(seq id no:5);
12、col2a1-r:ctagcccaaaaaaacccaatccta(seq id no:6);
13、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的荧光探针序列为:
14、sept9-p:aaccccgcgatcaacg(seq id no:7);
15、探针的5’端标记有荧光报告基团vic,3’端标记有荧光淬灭基团bhq1;
16、特异性检测基因elmo1甲基化区域的荧光探针序列为:
17、elmo1-p:agggttttcggcgattagagtttcg(seq id no:8);
18、探针的5’端标记有荧光报告基团fam,3’端标记有荧光淬灭基团bhq1;
19、内参基因col2a1的特异性探针序列为:
20、col2a1-p:agaagaagggaggggtgttaggagagg(seq id no:9);
21、探针的5’端标记有荧光报告基团cy5,3’端标记有荧光淬灭基团bhq2。
22、作为本发明进一步的方案,所检测的基因sept9和elmo1特定区域序列含有多个cpg二核苷酸结构,并且cpg二核苷酸结构的c碱基存在甲基化基团修饰。
23、作为本发明进一步的方案,还包括特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针以及特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针;
24、所述特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针序列为:
25、sept9-b:ttagttgtgtgttgattgtgggg(seq id no:10);
26、所述特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针序列为:
27、elmo1-b:caataataacaaatcaccaaaactctaatcaccaaaa(seq id no:11)。
28、一种用于胃癌检测的试剂盒,包括本发明中提到的引物探针组合物、核酸提取试剂、核酸转化试剂pcr mix、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
29、本发明具有以下有益效果:
30、本发明的引物探针组合物用于扩增基因sept9和elmo1特定的cpg位点富集区域。利用本发明的方法,特定的cpg位点富集区域高甲基化状态时可被特异性扩增,低或无甲基化状态时则无法扩增。本发明的试剂盒包括基因sept9和elmo1甲基化引物和探针,还包括内参基因col2a1的引物和探针。
31、通过本发明试剂盒可同时检测基因sept9和elmo1甲基化状态,基因sept9和elmo1甲基化状态可作为胃癌标记物,实现胃癌的检测。
32、本发明采用多重荧光定量pcr检测方法,特异性和灵敏度较高、重复性好,操作简单,能帮助临床医生更加精准评估胃癌病变风险,提高胃癌检出率,从而降低胃癌死亡率。
33、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效,下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
1.一种用于胃癌检测的引物探针组合物,其特征在于,包括特异性检测基因sept9甲基化区域的引物和荧光探针、特异性检测基因elmo1甲基化区域的引物和荧光探针、内参基因col2a1的特异性引物和探针;
2.如权利要求1所述的一种用于胃癌检测的引物探针组合物,其特征在于,所检测的基因sept9和elmo1特定区域序列含有多个cpg二核苷酸结构,并且cpg二核苷酸结构的c碱基存在甲基化基团修饰。
3.如权利要求2所述的一种用于胃癌检测的引物探针组合物,其特征在于,还包括特异性检测基因sept9甲基化区域的封阻探针以及特异性检测基因elmo1甲基化区域的封阻探针;
4.一种用于胃癌检测的试剂盒,其特征在于,其引物探针组合物如权利要求1-3任一所述的引物探针组合物。
5.如权利要求4所述的一种用于胃癌检测的试剂盒,其特征在于,还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂pcr mix、阳性对照和阴性对照中的至少一种。