一种基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型的构建方法与应用

本发明属于疾病模型，具体涉及一种基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型及其构建方法，用于皮肤结核疾病的研究及药物研发。

背景技术：

1、结核病对全球公共健康构成重大威胁，据世界卫生组织(who)估计，约有20％至40％的世界人口受到影响，每年有800万至900万新的活动性病例。皮肤结核(cutaneoustuberculosis)是结核病的一种，由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)直接侵犯皮肤或者由其它脏器结核灶内的结核分枝杆菌经血行或淋巴系统播散到皮肤组织所致的皮肤损害。在所有报告的肺外结核病病例中，皮肤结核的发病率仅为1-1.5％，随着耐多药结核菌株的增加，其发病率也在不断上升。尽管不常见，其诊断、临床表现、发病机制和分类都很复杂，给诊断、治疗带来一定的挑战。因此，对皮肤结核认识的提高，有助于对这种日益常见的皮肤疾病进行正确的诊断和管理。

2、小鼠是人类疾病的常用模型。然而，小鼠和人类之间生理学的差异，并且皮肤之间存在着关键性差异，例如伤口闭合机制不同，阻碍了临床研究和治疗方法的临床转化。因此，迫切需要体外人类等效皮肤模型，用作研究工具。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型及其构建方法。本发明利用人诱导多能干细胞(hipsc)构建的带附属器和免疫细胞的复杂皮肤类器官为靶器官，用结核分枝杆菌h37rv感染该皮肤类器官以建立皮肤结核疾病模型，并对该模型进行鉴定，从而进一步用于皮肤结核疾病的研究及药物研发。

2、本发明所提供的基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型是按照下述构建方法制备得到的：

3、1)利用人诱导多能干细胞(hipsc)构建带毛囊附属器的皮肤类器官；

4、2)用结核分枝杆菌感染步骤1)制备的皮肤类器官，得到皮肤结核疾病模型。

5、上述方法步骤1)中，构建带毛囊附属器的皮肤类器官的详细方法可按照现有技术的公开的方法进行制备，如果可参照karl rk课题组的方法进行制备(参考文献：nature.2020jun；582(7812):399-404)。

6、上述方法步骤2)中，所述用结核分枝杆菌感染步骤1)制备的皮肤类器官的具体方法如下：将皮肤类器官在感染前3天更换无抗生素类器官成熟培养基(organoidmaturation medium，omm)；感染当天，将皮肤类器官转移到新的24孔板上，并再次更换新鲜的无抗生素omm培养基；在每孔中加入结核分枝杆菌(h37rv)悬液，并在37℃，5％ co2条件下继续培养8-10天，每2-3天更换一次培养基。

7、进一步地，所述结核分枝杆菌具体为结核分枝杆菌h37rv。

8、进一步地，所述结核分枝杆菌在24孔板的每个孔的接种终浓度为1×107cfu/ml。

9、上述方法还包括在步骤2)后，对得到皮肤结核疾病模型用抗酸染色法和/或免疫荧光法和/或he染色法进行鉴定的步骤。

10、采用上述方法构建的基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型也属于本发明的保护范围。

11、本发明还提供了所述基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型在下述任一中的应用：

12、a1)在筛选或开发人或动物皮肤结核疾病的候选治疗药物中的应用；；

13、a2)在筛选或开发抑制人或动物皮肤结核疾病进展的候选药物中的应用；

14、a3)在筛选筛选人或动物皮肤结核疾病的药物靶点中的应用；

15、a4)在人或动物皮肤结核疾病的研究中的应用。

16、由人多能干细胞构建的3d皮肤类器官具有和人类皮肤相似的结构，具有角质化的表皮、真皮、基底细胞、毛囊、感觉神经元、施旺细胞和黑色素细胞等带有附属器的近乎完整的皮肤类器官，是一种用于皮肤疾病研究的理想模型。本发明利用人诱导多能干细胞(hipsc)构建的带附属器和免疫细胞的复杂皮肤类器官为靶器官，用结核分枝杆菌h37rv感染该皮肤类器官以建立皮肤结核疾病模型，并对该模型进行鉴定，为了解结核分枝杆菌感染皮肤后疾病的发生、发展、免疫反应、筛选药物研发新靶点和测试药物反应提供理想的工具。

技术特征：

1.基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型的构建方法，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌h37rv。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述结核分枝杆菌在每个孔的接种终浓度为1×107cfu/ml。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤2)后，对得到皮肤结核疾病模型用抗酸染色法和/或免疫荧光法和/或he染色法进行鉴定的步骤。

6.权利要求1-5中任一项所述方法构建得到的基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型。

7.权利要求6所述的基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型在下述任一中的应用：

技术总结
本发明公开一种基于人皮肤类器官的皮肤结核疾病模型及其构建方法与应用。本发明利用人诱导多能干细胞(hiPSC)构建的带附属器和免疫细胞的复杂皮肤类器官为靶器官，用结核分枝杆菌H37Rv感染该皮肤类器官以建立皮肤结核疾病模型，并对该模型进行鉴定，为了解结核分枝杆菌感染皮肤后疾病的发生、发展、免疫反应、筛选药物研发新靶点和测试药物反应提供理想的工具。

技术研发人员：檀英霞,岳亮,贠志敏,钟鹏飞,邱啸臣,保鹏涛,樊士勇
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17