一种抗体及其配套猪精冷冻试剂盒的制作方法

本发明属于基因工程，特别涉及一种抗体及其配套猪精冷冻试剂盒，更具体的，涉及一种快速检测猪精中猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒的抗体，及其在猪精液冷冻保存中的应用。

背景技术：

1、随着科学技术的发展，人们的生活水平不断提高，对畜产品的需求也越来越高，需求量也越来越大，养猪业在畜牧产业体系中占有重要地位，随着养猪业集约化、规模化程度的不断提高，人工授精技术也在不断地发展完善并被广泛地应用，成为改良猪品种和育种最直接有效的途径。为了改善当地的猪种质量，从外地甚至国外直接进口冷冻猪精也成为了一种新的引种手段，但随之而来的健康公猪精液携带毒传播的问题也日益复杂化和严重化。

2、研究显示，猪瘟病毒(classical swine fever virus，csfv)、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)，猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，prrsv)等病毒是在引进种公猪精液中最常见被检出的几种病原，是引发猪繁殖障碍性疫病的重要病毒性病原。上述病毒的临床症状主要表现为患病妊娠母猪流产、早产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等，还可以引起哺乳仔猪及保育猪发病或死亡。这几种病原不仅能水平传播，还能通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播。可见，种公猪精液是繁殖障碍性疫病病原传播的重要媒介。随着分子生物学技术的发展，快速、高效的分子生物学方法成为繁殖障碍性疾病重要的检测手段。

3、但是现有技术中已知的常见检测手段往往针对的是待测猪的血清、组织样品等病毒载量较大的样品，并没有专门针对猪精的检测试剂和检测手段。而且，常规rt-pcr方法虽然可以检测病毒基因组，能相对准确的作出诊断，但是存在漏检和交叉污染现象，而且需要复杂的操作和仪器，难以快速、大批量的同时对多种病原体进行检测，往往需要多次试验才能获得相应的结果，费时费力，关键的是浪费原本就很珍贵的冻精样品。

4、因此，迫切的需要一种可以同时对猪冻精中的上述几种病毒进行检测的检测试剂及其检测方法。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有技术中的上述问题，提供了一种可以同时识别猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒流行毒株的新抗体。

2、具体而言，本发明首先提供一种融合表达上述毒株优化后的抗原表位，形成新的抗原表位融合蛋白cpp，所述抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.1所示。

3、本发明还提供了一种特异性识别上述抗原表位融合蛋白cpp的纳米抗体cpp-nb1，所述纳米抗体cpp-nb1的氨基酸序列如seq id no.2所示

4、本发明还提供了一种编码上述纳米抗体cpp-nb1的核酸分子，核苷酸序列如seqid no.3所示。

5、本发明还提供了一种包含上述纳米抗体cpp-nb1和标记位点的融合蛋白。

6、本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的重组质粒，所述重组质粒的基础载体包括原核表达载体。

7、本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将上述重组质粒转入感受态细胞内，利用iptg进行诱导表达，收集包涵体蛋白，纯化后进行所述标记位点的标记。

8、本发明还提供了上述纳米抗体cpp-nb1、上述融合蛋白或上述重组质粒在制备检测猪精液中上述三种病原抗体的试剂中的应用。

9、本发明还提供了一种同时检测猪精液中猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒流行毒株的检测试剂盒。进一步地，所述试剂盒的检测方法包括酶联免疫法、化学发光检测法、蛋白质印迹检测法或者免疫组化法。

10、进一步的，本发明提供一种猪精液冷冻试剂盒，其中包括检测组件和冷冻组件，其中检测组件中包括抗原表位融合蛋白cpp和/或纳米抗体cpp-nb1，冷冻组件中包括：

11、基础稀释液：

12、bts：37g/l葡萄糖,1.25g/l edta二钠,6g/l柠檬酸钠,0.75g/l氯化钾,1.25g/l碳酸氢钠，300mg/l庆大霉素。

13、tcg：5.5g葡萄糖,7.4g柠檬酸钠,12.0g tris,青霉素、链霉素各50万单位，100ml卵黄，蒸馏水500ml。

14、ⅰ液：bts与tcg按照体积比1:1配伍。

15、ⅱ液：ⅰ液中加入终浓度为6％甘油。

16、稀释步骤：按照不低于4×108个/ml的最终浓度计算所需稀释液总量。加入所需总体积一半体积的ⅰ液对新鲜精液进行稀释，4℃平衡1.5h，再加入与ⅰ液等体积的4℃预冷的ⅱ液，立即进行细管分装、冷冻。

17、有益效果

18、本发明所述的抗体可用于检测样本中是否含有猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒的常见流行毒株。因此可以快速的应用在外来猪冻精的检测过程中，可便捷、快速、准确的检测上述三种病原体，有效的阻断上述病原的垂直传播，防止疾病的发生。本发明的检测试剂可以与猪精液稀释液配套使用，保证产品的纯净，可以大范围应用在猪场的精液保存和经营中，整顿公猪精液市场,加强检疫,淘汰健康带毒猪,搞好种公猪疫病的净化,取得良好的经济和社会效益。

技术特征：

1.一种包含猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒流行毒株的抗原表位融合蛋白，其特征在于将上述三种病毒优化后的抗原表位，形成新的抗原表位融合蛋白cpp，所述抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.1所示。

2.一种特异性识别权利要求1所述抗原表位融合蛋白cpp的纳米抗体cpp-nb1，所述纳米抗体cpp-nb1的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.如权利要求1所述的抗原表位融合蛋白、权利要求2所述的纳米抗体cpp-nb1在制备检测猪精液中猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂中的应用。

4.一种猪精液冷冻试剂盒，其中包括检测组件和冷冻组件，其中检测组件中包括权利要求1所述的抗原表位融合蛋白和\或权利要求2所述的纳米抗体cpp-nb1，冷冻组件中包括：

技术总结
本发明提供一种抗体及其配套猪精冷冻试剂盒，本发明所述的抗体可用于检测样本中是否含有猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒的常见流行毒株。因此可以快速的应用在外来猪冻精的检测过程中，可便捷、快速、准确的检测上述三种病原体，有效的阻断上述病原的垂直传播，防止疾病的发生。本发明的检测试剂可以与猪精液稀释液配套使用，保证产品的纯净，可以大范围应用在猪场的精液保存和经营中，整顿公猪精液市场,加强检疫,淘汰健康带毒猪,搞好种公猪疫病的净化,取得良好的经济和社会效益。

技术研发人员：王莉娟,张姣姣,李强,曹伟,刘园,高慧纯,余易展,刘政权,张勇,洪宁
受保护的技术使用者：四川省畜牧总站
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24