一种1-辛烯-3-醇生物合成活性提高的双功能脂氧合酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种1-辛烯-3-醇生物合成活性提高的双功能脂氧合酶突变体及其应用。

背景技术：

1、脂氧合酶(lox)广泛存在于细菌、藻类、植物和动物中，以含一个或一个以上(z,z)-1,4戊二烯结构单元的多聚不饱和脂肪酸(pufa)为底物，可产生一系列脂肪酸氢过氧化衍生物，是许多生物中一些重要功能物质合成的前体。

2、现有技术中从一些低等生物(包括蓝藻、红藻、绿藻)中获取的脂氧合酶还表现了双功能活性，以不同pufa为底物时，可以一步催化脂肪酸形成不同的短链芳香性化合物，如中国专利cn104560390a所述，从红藻坛紫菜(pyropiahaitanensis)克隆的双功能酶phlox，可以利用不同植物油为底物合成多种c5、c6、c7、c8、c9-烯醛类香料。又如中国专利cn113286890a所述，从绿藻小枝刚毛藻(cladophoraoligoclara)和裂片石莼(ulvafasciata)分离出的双功能lox，可以从不同的pufa底物中产生大量的癸二烯醛和/或癸三烯醛。即说明，这些低等生物来源的脂氧合酶具备lox-hpl双功能活性，是一类在短链芳香性化合物酶法生产中非常具有潜力的生物催化剂。

3、1-辛烯-3-醇，又称松蕈醇，是一种带有强烈愉悦感的土壤香香气、蘑菇香气和甘草香气融合的化合物，自然界中主要存在于薄荷类、百里香以及鲜蘑菇中。1-辛烯-3-醇也是一种自我刺激的氧脂信使，在植物细胞反应、植物-草食动物相互作用和植物-植物相互作用中充当信号分子，如中国专利cn202110080870.4公开了1-辛烯-3-醇在防治水果采后病害中的应用，1-辛烯-3-醇处理能抑制猕猴桃常温和低温贮藏条件的自然发病率，对常温条件下猕猴桃采后青霉病和灰霉病具有良好的控制作用，作用机制是抑制青霉和灰霉的生长。

4、除了从天然物(如植物组织或植物精油)中提取外，1-辛烯-3-醇的制备还可以通过有机化学合成和酶催化而获得。其中，1-辛烯-3-醇有机化学合成可以通过grignard试剂的反应或者羟醛缩合法制备，但前者因需要使用大量的乙醚致使生产过程不安全且反应条件复杂，而后者在产物中因含有难以去除的含硫化合物从而不适用于食品、化妆品中。中国专利cn104591968a提出了一种新的1-辛烯-3-醇化学合成方法，过程中采用甲基叔丁基醚作为溶剂，从而可以避免乙醚爆炸的危险，但合成工艺仍然需要经过低温化、调酸、蒸馏等相对繁琐的步骤，不仅会产生一定量的废水，而且存在生产成本较高，起始原料难于获取等问题。

5、与有机化学合成法相比，酶法制备1-辛烯-3-醇具有环保性和安全性的优点。其生产方式大致包括了3种类型的生物催化剂的应用，一是单纯以植物提取液为催化剂，如中国专利cn1563310a和中国专利cn101225406a；二是以重组的脂氧合酶联合植物提取液为催化剂，三是以低等生物来源的天然双功能脂氧合酶为催化剂。粗酶提取物或双酶联用方法存在反应体系不好控制、酶活不稳定、产物得率低等不良现象。而现有技术中利用天然双功能脂氧合酶催化脂肪酸合成短链芳香化合物的转化效率低下，不适于生产应用。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种1-辛烯-3-醇生物合成活性提高的双功能脂氧合酶突变体及其应用。本发明提供的双功能脂氧合酶突变体由坛紫菜脂氧合酶经一个氨基酸位点突变而来，其在ph7.2、温度25℃条件下，可以一步催化42.9％～67.1％的花生四烯酸快速转化为1-辛烯-3-醇，适于生产上的需求。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种脂氧合酶突变体，氨基酸序列如seq id no.18～seq id no.20任一项所示。

4、本发明提供了上述技术方案所述脂氧合酶突变体的编码基因，核苷酸序列如seqid no.15～seq id no.17任一项所示。

5、本发明提供了一种表达脂氧合酶突变体的重组载体，包括上述技术方案所述的编码基因和原始载体。

6、优选的，所述原始载体包括pet-28a(+)表达载体。

7、本发明提供了一种表达脂氧合酶突变体的重组菌，所述重组菌包括上述技术方案所述的重组载体和原始菌株。

8、优选的，所述原始菌株包括大肠杆菌(escherichiacoli)。

9、优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21菌株。

10、本发明提供了上述技术方案所述的脂氧合酶突变体或上述技术方案所述的编码基因或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述重组菌在合成1-辛烯-3-醇中的应用。

11、本发明提供了一种提高酶法催化花生四烯酸合成1-辛烯-3-醇产量的方法，包括以下步骤：

12、将上述技术方案所述重组菌发酵，分离得到脂氧合酶蛋白突变体；

13、将所述脂氧合酶蛋白突变体和花生四烯酸混合反应，得到1-辛烯-3-醇。

14、优选的，所述混合反应的温度为20～30℃，ph值为7.0～8.0。

15、有益效果：

16、本发明提供了一种脂氧合酶突变体，氨基酸序列如seq id no.18～seq id no.20任一项所示。本发明通过将坛紫菜脂氧合酶经一个氨基酸位点突变得到脂氧合酶突变体，其在ph7.2、温度25℃条件下，可以一步催化42.9％～67.1％的花生四烯酸快速转化为1-辛烯-3-醇，适于生产上的需求。

技术特征：

1.一种脂氧合酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.18～seq id no.20任一项所示。

2.权利要求1所述脂氧合酶突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq idno.15～seq id no.17任一项所示。

3.一种表达脂氧合酶突变体的重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述的编码基因和原始载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体包括pet-28a(+)表达载体。

5.一种表达脂氧合酶突变体的重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求3或4所述的重组载体和原始菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述原始菌株包括大肠杆菌(escherichia coli)。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bl21菌株。

8.权利要求1所述的脂氧合酶突变体或权利要求2所述的编码基因或权利要求3或4所述的重组载体或权利要求5～7任一项所述重组菌在合成1-辛烯-3-醇中的应用。

9.一种提高酶法催化花生四烯酸合成1-辛烯-3-醇产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述混合反应的温度为20～30℃，ph值为7.0～8.0。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种1‑辛烯‑3‑醇生物合成活性提高的双功能脂氧合酶突变体及其应用。本发明提供的双功能脂氧合酶突变体由坛紫菜脂氧合酶经一个氨基酸位点突变而来，其在pH 7.2、温度25℃条件下，可以一步催化42.9％～67.1％的花生四烯酸快速转化为1‑辛烯‑3‑醇，适于生产上的需求。

技术研发人员：朱竹君,李艳荣,吴心茹,李佳,陈海敏,严小军
受保护的技术使用者：宁波海洋研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17