一种PBMC细胞永生化的培养方法与流程

本发明属于细胞永生化，具体涉及一种pbmc细胞永生化的培养方法。

背景技术：

1、人外周血单核细胞(pbmc)是免疫学中最常用的一种生物样本，其中包含约70％t淋巴细胞、15％b淋巴细胞、5％单核细胞、1％树突状细胞和10％自然杀伤细胞。永生化人外周血样本中的b淋巴细胞，从而保留人类遗传资源，可以为出生缺陷及其它罕见疾病的遗传流行病学、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性实验材料。

2、细胞永生化的方式众多，其中eb病毒(epstein-barr virus,ebv)转化外周血b淋巴细胞因具有取样方便、操作简单、基因型保存良好等优点而最为常用。eb病毒可通过结合b淋巴细胞表面的eb病毒受体感染b淋巴细胞，使其永生化，成为一种能连续分裂、无限增殖的类淋巴母细胞系(b lymphoblastoid cell lines,lcls)，且每一株永生化细胞系均保存原血液提供者个体的完整基因组及其生化与分子生物学特性。目前，该方法仍存在永生化成功率较低以及培养时间长达1个月以上等问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在开发新的pbmc细胞永生化方法，且该方法具有更高的成功率和更短的培养时间，以降低细胞永生化成本。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

3、本发明第一方面提供了一种pbmc细胞永生化的培养方法，包括以下步骤：

4、s1、配制包括ebv、pbmc和培养基的ebv感染体系，进行培养；

5、s2、在培养过程中，至少一次部分更换永生化培养基，培养直至细胞永生化成功；

6、所述永生化培养基以rpmi-1640为基础培养基，并含有10-30％(v/v)fbs(胎牛血清)、1％(v/v)青链霉素混合液、15mm hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、1％(v/v)glutamax、1-50ng/ml egf(表皮生长因子)、1-50ng/ml bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)、0.1-5μg/ml氢化可的松、1-5μg/ml pha(植物凝集素)和0.1-2μg/ml cyclosporin a(环孢素a)。

7、本发明从永生化过程所用的培养基着手，通过大量的摸索实验，开发了一种适宜于b淋巴细胞永生化的新型培养基，并基于该培养基优化了培养方案；实施例数据表明，相对于其他培养基，本发明的培养方案可有效缩短永生化时间并提高永生化成功概率。

8、优选地，在本发明所述的培养方法中，步骤s2更换永生化培养基的同时补加ebv；实施例数据表明，在本发明的永生化过程中，持续维持ebv浓度可提高永生化成功的细胞数目，提高永生化细胞的生长速度。

9、更优选地，在本发明所述的培养方法中，步骤s2更换永生化培养基的同时，还可以补加fbs，且fbs补加量为永生化培养基更换量的10-30％(v/v)。

10、优选地，在本发明所述的培养方法中，步骤s1包括以下步骤：

11、s11、利用b95-8细胞获得ebv；

12、s12、取新鲜血液，利用ficoll分离液获得人外周血pbmc，用永生化培养基重悬得到细胞悬液；或取冻存血液，解冻后加hbss，离心得细胞沉淀，用永生化培养基重悬得到细胞悬液；

13、s13将ebv、步骤s12所得细胞悬液以及永生化培养基配制成ebv感染体系。

14、在本发明的培养方法中，pbmc既可来源于新鲜血液，也可来源于冻存血液，而现有技术中的b淋巴细胞永生化方法通常仅适用于新鲜血液。

15、更优选地，在本发明所述的培养方法中，当所述pbmc来源于新鲜血液时，步骤s2包括以下步骤：

16、s21、将ebv感染体系短时间孵育后，补加永生化培养基后继续培养；

17、s22、培养4-10天后，吸弃部分培养基，补加新鲜的永生化培养基；

18、s23、重复步骤s22，直至永生化成功。

19、更优选地，在本发明所述的培养方法中，当所述pbmc来源于冻存血液时，步骤s2包括以下步骤：

20、s21、在ebv感染体系中额外添加fbs，培养4-10天后，补加新鲜的永生化培养基；

21、s22、再次培养4-10天后，离心收集细胞沉淀，将细胞上清离心去除细胞碎片并用所得上清重悬细胞沉淀，补加新鲜的永生化培养基；重复该步骤，直至有明显的淋巴细胞聚团；

22、s23、每4-10天吸弃部分培养基并补加新鲜的永生化培养基，或每4-10天用新鲜的永生化培养基1:2扩大培养一次，直至永生化成功。

23、优选地，在本发明所述的培养方法中，还包括步骤s3，以获取并冻存永生化b淋巴母细胞系，具体包括以下步骤：

24、s31、以永生化成功的细胞为p0初代细胞，p1与p2代传代时，细胞长满则补加等体积新鲜的永生化培养基1:2传代，5天传代1次；

25、s32、细胞长满则补加等体积新鲜的20生长培养基1:2传代，根据细胞生长速度3-5天传代1次，传代2次；

26、s33、细胞长满则补加等体积新鲜生物10生长培养基1:2传代，根据细胞生长速度2-3天传代1次，传代2次；

27、s34、将s33所得细胞液离心后重悬于冻存液中进行冻存。

28、优选地，在本发明所述的培养方法中，步骤s2鉴定永生化成功的方法至少为以下任一：

29、a1)鉴定b淋巴细胞的细胞膜表面标志蛋白cd45和cd19的表达水平，且cd45+cd19+阳性群≥90％则表示永生化成功；

30、a2)提取永生化细胞的rna，以人b细胞抗体轻链k恒定区mrna序列为标志，利用seqid no.1-2所示测序引物检测mrna水平；

31、a3)提取永生化细胞的的基因组dna，通过qpcr扩增曲线检测细胞基因型与血液提供者是否一致。

32、在本发明所述的培养方法中，进一步构建了一种多维度鉴定b淋巴细胞永生化的方式，使得鉴定结果更为准确、可靠。

33、本发明第二方面提供了一种类淋巴母细胞系，其具体通过本发明所述pbmc细胞永生化的培养方法构建所得。

34、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

35、(1)本发明提供了一个适用于pbmc永生化的新型培养基，并基于该培养基开发了适用于pbmc细胞永生化的培养方法，相对于现有技术中其他培养基和培养方法，本发明可将细胞永生化时间缩短至21天，而且显著提高了成功率，所得细胞活力更高。

36、(2)在本发明的技术方案中，通过在pbmc细胞永生化过程中持续添加ebv病毒，显著提高了所建立的类淋巴母细胞系的细胞活力。

37、(3)本发明利用培养基对永生化细胞进行驯化，简化了永生化细胞培养条件，节省成本，易于永生化细胞的持续获得与传播。

38、(4)通过本发明方法，无需新鲜采集的血液，冻存全血亦可生成永生化b淋巴细胞，显著扩大遗传资源的保存应用范围。

39、(5)在本发明方法中，同时构建了一套多维度鉴定b淋巴细胞永生化的策略，即：检测b淋巴细胞细胞膜表面标志蛋白cd45、cd19表达水平，检测人b细胞抗体轻链k恒定区mrna水平，以及检测细胞提供者特有基因型一致性；该鉴定方式更为全面，结果可靠性高。